Viability PCR在活性微生物检测领域的研究进展

2021-09-14姜大勇解恒杰伊廷存徐立清霍胜楠程祥龙

药学研究 2021年8期

姜大勇，解恒杰，伊廷存，徐立清，霍胜楠，程祥龙

(山东省食品药品检验研究院，山东济南 250101)

在微生物检测领域，采用快速灵敏的检测技术确定活性微生物的存在或数量正变得越来越重要。评估微生物的活性是许多微生物学领域的主要要求，包括微生物多样性[1]、微生态学[2-3]、风险评估[4-5]、临床诊断[6-7]和食品安全[8-9]。传统分子生物学检测技术虽然具有快速、高效、特异性高等优点，但其局限性在于无法区分死细胞和活细胞，从而高估了样品中存在的细胞数量。vPCR正是一种有效区分死细胞和活细胞的检测方法。

Viability polymerase chain reaction(vPCR)是对标准PCR检测方法的改进，基于DNA结合染料和活性细胞具有完整的细胞膜概念提出。常用DNA结合染料包括单叠氮化乙锭(ethidium monoazide EMA)、单叠氮化丙锭(propidium monoazide PMA)及其衍生物PMAxx和PEMAX等。这些生物染料是带正电荷的分子，被完整的带负电荷的细菌细胞壁/细胞膜所排斥，但会进入细胞壁/膜受损的细菌，在暗孵育期间染料与DNA共价结合，经曝光处理后染料对DNA进行修饰，改变DNA结构，从而抑制后续扩增[10]。

从2003年vPCR概念的提出[10]到今天，已经在细菌、真菌、病毒等方面得到了广泛的应用，并公布了多种技术方案。然而，完全抑制目标样本中死细胞的DNA信号仍存在一定困难[9]。无法完全排除死细胞中的DNA信号势必产生假阳性结果从而导致微生物风险的高估。围绕改善这一目标的关键因素，对vPCR的许多变量和参数进行了大量的优化和验证工作，以提高vPCR技术的准确度和可重复性。为更好地开展vPCR试验，本文综述了近年来vPCR技术在活性微生物领域的研究进展。

1 目标微生物

VPCR的提出是基于细胞膜的结构完整性[10]，认为任何具有完整细胞膜的微生物是活的，且具有代谢活性。然而，有研究表明，在某些情况下营养细胞会失去代谢活性但具有完整的细胞膜，此类细胞被称为“幽灵细胞”，对一些最常用的活性染料如单叠氮丙啶(PMA)是不可渗透的[10]。

对于营养细胞，而不是孢子，活的概念也可能与通过位于细胞膜上的活性转运通道维持细胞内稳态的能力有关[11]。

EMA是具有低分子量和低电荷的衍生物，可以穿过完整的细胞膜。在低浓度下，代谢活跃的细胞可以有效地将EMA排出到细胞外，死细胞和“幽灵细胞”却不具备此能力。根据这一发现，开发了一种含有不同浓度的低分子染料和高分子染料混合试剂。通过对两种染料浓度的调整，可以有效抑制“幽灵细胞”和死细胞中的DNA扩增，而不影响活细胞扩增[12]。

另外基于细胞膜完整性概念的质疑，为解决“幽灵细胞”的干扰，提出了基于代谢活性区分死细胞和活细胞的概念，并开发了两种替代的光敏反应分子染料，DyeTox13 Green C-2 Azide[13]和thiazole orange monoazide[14]。但该新分子染料的性能，仍需要进一步的研究。

2 塑料微管

聚丙烯微管由于具有半透明，化学及温度稳定性较好的特点，多应用与分子反应中。但由于游离或变性的DNA可以附着在聚丙烯管壁上[15]，会导致部分DNA因附着在管壁上，无法与vPCR中的染料结合，致使假阳性结果的出现[16]。

为解决这一问题，Moreno等[17]提出在vPCR中使用低结合性微管降低塑料管壁与DNA的附着性。这一想法被实验证明，表明DNA与塑料微管表面的相互作用可以影响vPCR检测的成败[18]。另外，为降低微管壁与DNA的相互作用，还可以采用换管法，在黑暗的孵育后更换微管，在光激活后换管，试验证明均可防止假阳性结果[18-19]，且该方法已成功用于检测加标食品中的沙门氏菌属[20]。

3 活性染料

vPCR是基于EMA、PMA 等DNA结合染料提出来的。目前，EMA和PMA已广泛应用于微生物学检测中，并取得了很大的进步，但仍未完全解决假阳性结果的发生[21]。

有研究人员基于EMA和PMA的不同特点，开发了一种新方法，即PEMAX试剂，包含足够水平的EMA(<10 μmol·L-1)和PMA(≥20 μmol·L-1)混合[22]。低水平的EMA可以穿过完整的膜，并积聚在缺乏代谢能力的细胞中。高浓度的PMA则可以穿过破损的膜，与DNA充分结合。当样品中含有大量具有破损细胞膜的死细胞时，EMA与PMA的结合可提高结合DNA的强度，同时也避免了膜未受损和无新陈代谢活性细胞DNA的扩增[23-27]。

此外，针对细胞膜完整无活性细胞的检测，Lee等[14-15]开发了新的DNA结合材料dyeTox13 Green C-2 azide和thiazole orange monoazide，为活性微生物的检测提供新的路径。

目前PEMAX试剂已商业化，同时还有PMAxx。PMAxx是PMA染料的改良版，是一种疏水性更强的PMA，能更高亲和性地优先结合dsDNA，在区分死细胞和活细胞特异性方面更高[24-26]。

在文献中还发现了其他检测活细胞的方法。Soejima和他的同事们展示了基于钯金(Pd)[28]或铂金(Pt)[29]等金属化合物的潜力；Fraisse等[30]也证实了PtCl4在活细胞检测中的可行性。因此金属化合物有望成为下一代活细胞鉴别剂。这种替代方法具有更低的目标活细胞检测限和定量限，更少的繁琐操作，更低的成本以及潜在的更高通量分析[29-30]。Randazzo等[31]也证明了Pd-PCR用于评估病毒衣壳的完整性的巨大潜力。但该替代方法的缺点在于反应试剂存在下无法终止反应，且其反应原理和性能稳定性仍需进一步研究[30-32]。

4 试剂增强剂

vPCR反应的关键步骤是试剂和样品的暗孵育过程[23]，在孵育过程中使试剂最大化渗透进死亡的细胞、孢子和微生物聚集体，而不迫使染料渗透进具有完整结构的细胞。但样品基质的复杂性和细胞状态的多样性，势必影响试剂的渗透效果[33]。实验证明，可以采用试剂增强剂对反应体系的进行改进，从而促进死亡细胞膜或受损病毒衣壳的完整性的破坏，以增强死细胞和活细胞的区别度。

目前已被认可的反应增强剂有去氧胆酸钠，十二烷基硫酸钠(SDS)，月桂酰肌氨酸钠，二甲基亚砜(DMSO)、Igepal CA-630、Triton X-100和EDTA等。自2009年第一次将脱氧胆酸钠作为试剂增强剂以来，已在多种目标微生物中使用，并取得了相当的效果，具体见表1。

表1 试剂增强剂的应用

如表1所示，微生物种类不同，采用的试剂增强剂也不同，具体需要根据目标微生物的种类而定。研究证明，大多数反应助剂都能够提高vPCR的检测效率，但多数是针对革兰阴性微生物，基于某一特性可以扩大试剂增强剂的研究范围，如使用SDS作用与金黄色葡萄球菌，可以尝试将SDS应用于同是革兰阳性菌的李斯特氏菌。

总之，为了提高PMA处理的效果，加强对死亡细胞DNA的结合效率，降低对活细胞的损伤的反应助剂的研究，是一个不错的思路[42]。然而，反应助剂的使用要针对不同的物种、菌株，使用中还要考虑浓度带来的毒性。

5 暗孵育温度与时间

孵育温度与时间是vPCR实验需要考虑的重要因素之一。孵育的温度主要集中于冰温和室温(20～25 ℃)，合理的孵育温度，可以促进细胞膜的通透性和流动性，促进试剂的渗透性。目前孵育时间的共识是5～30 min左右，大量实践经验表明这一时间足以使试剂充分扩散，Lu等[43]验证了暗孵育时间的重要性。但不同种类的微生物具有不同的特征，革兰阳性菌细胞壁要比革兰阴性菌厚，不利于试剂的扩散。此外有实验证明，结核分枝杆菌最佳孵育时间是120 min。因此，孵育温度与时间的选择，应充分目标微生物的细胞结构特征。必要的情况下，可以通过搅拌促进试剂的渗透性。

6 质控措施

在vPCR反应过程中，质控措施的有效实施也是非常重要的。质控措施，如对样品处理的管理、DNA提取质量评估、仪器性能和数据分析等，能够有效评估PCR反应的效率，并判断试验的成败与否。

在样本检测过程中，DNA的提取可能会受到部分抑制剂的影响。一方面，在试验过程中，采用DNA/RNA比值作为标准来判断DNA质量，可以提高PCR的检测效率。同时，样本与DNA结合染料作用效果也应考虑到，如一些样本结合活性染料后的PCR效率较低，因此，应对不同性能造成的量化误差进行修正[44]。另一方面，为了确定环境样品中DNA结合染料预处理的有效性，应设计一套针对环境和食品中相关样品的强有力的对照，此类对照应包含目标微生物[45]。PCR反应结果的不确定性，应当设置一定浓度的死细胞作为内部参照，以评估PCR反应的充分性[46]。

7 检测方法策略的优化

为提高vPCR的检测效率和可靠性，除了进行上述措施的优化外，还可采用不同方法和策略的优化组合，以获得更好的协同效应。

有研究表明，采用两个光激活期和两个光激活期之间进行短暂暗孵育的方法，可以增加vPCR的性能[20，25]。采用此方法，可以提高PCR循环阈值约3 Ct。另外，DNA结合染料经过一次光激活，并不能完全转换成羟胺，进行两次光激活可以使光化学交联到多核苷酸上的收益率接近40%～75%[26-27]。

此外，还有学者将低结合度微管与Triton缓冲液处理相结合，成功地应用于临床评估甲型肝炎病毒和诺如病毒的感染性[17,47]。另一方面，采用更换微管和双光处理方法也成功地应用于李斯特菌单核细胞检测[24]，并且换管方法在军团菌属细胞中也显示出了有价值的结果[21]。在这些论文中，这些不同方法的结合已经实现了减少死亡沙门氏菌属或单核细胞增生李斯特菌和军团菌属细胞的荧光信号。