间充质干细胞外泌体治疗神经退行性疾病的研究进展

马艺菡，王思乐,2， 段 逵, 2

(1.昆明理工大学灵长类转化医学研究院，云南 昆明 650500； 2.云南中科灵长类生物医学重点实验室, 云南 昆明 650500)

0 引 言

外泌体(exosomes)是由细胞分泌产生的脂质双分子层膜囊泡[1]，细胞外囊泡一般包括外泌体、微囊泡及凋亡小体[2].外泌体源于晚期胞内体( 又称多囊体，multivesicular bodys，MVBs) ，电镜下观察呈杯状结构，直径为 30 ～150 nm[3].外泌体可以由各种不同的细胞分泌，如小胶质细胞、淋巴细胞等. 外泌体可以在机体多种生理病理过程中发挥重要作用，是近些年来生物医学领域研究的热点问题[4].1983 年，外泌体首次被 JOHNSTONE等[5]在绵羊的网织红细胞培养液上清中发现，直到 1989 年才被正式命名[6].外泌体内含有与其来源细胞相类似的细胞因子、生长因子等蛋白质，以及脂质、mRNA 或非编码 RNA 等生物活性物质[7-9].之后的研究还发现泌体具有低免疫原性、较长的半衰期及穿过血脑屏障的能力，外泌体能够参与脑损伤等发生后的血管新生、神经再生、突触可塑性等诸多病理过程，其中miRNA介导的信号网络更是在神经退行性疾病的大脑修复过程中起到关键性作用[10].

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)等神经系统退行性和损伤性疾病, 都是危害人类健康的重大疾病, 但目前预后较好和有效的治疗方法仍然匮乏.目前有研究表明 MSCs 治疗效果可能主要是通过产生的外泌体发挥作用[11-12].MSCs可以产生大量的外泌体，并且MSCs可以分泌具有强免疫调节活性的生物活性因子、抑制纤维化和凋亡，增强血管生成并促进神经元存活和分化[13]，因此被大量用来进行神经修复.越来越多的研究表明，外泌体的内容物有助于促进神经退行性疾病的途径，比如与β淀粉样肽 (Aβ) 堆积在大脑中形成的淀粉蛋白斑相关的患有阿尔兹海默症的患者，还有帕金森疾病中含有α-突触核蛋白的蛋白质的病理聚集体也是通过外泌体转移到中枢神经系统.在试图解决这种衰弱的神经病理学的过程中，外泌体的发展在于可以将其作为自然输送的载体用于疾病的治疗中.因此，MSCs释放的外泌体有望成为一种新兴的神经退行性疾病的纳米治疗剂.

1 MSCs的基本特征和生物学功能

1.1 MSCs的基本特性

MSCs是很容易获得的原代细胞之一，可以很容易地从各种组织中获得，如脂肪组织、脐带、肝脏、羊水和胎盘，以及牙髓和其他来源.这些细胞可以分化为间充质和非间充质细胞谱系[14].MSCs易于分离和具有特殊的生物学功能，使其成为临床前和临床试验中细胞治疗的热门选择.

1.2 MSCs的生物学功能

MSCs具有多向分化能力，它们的特点是有可能分化成多种间充质细胞谱系，如骨、脂肪、软骨和肌肉，以及非间充质细胞谱系，如神经元、胶质细胞和肝细胞.这些特性使MSCs成为组织工程和再生医学的种子细胞类型，包括骨和软骨重建、神经再生和血管组织修复[15].MSCs能够迁移到损伤组织，释放细胞因子、炎症介质、细胞外基质成分和抗菌蛋白，为组织修复产生合适的微环境.此外，MSCs还会抑制其他免疫细胞亚群在适应性免疫和先天性免疫中的功能.这些特性为MSCs在临床上的移植试验提供了理论基础[16]，并进一步支持了研究MSCs在器官移植中以及自身免疫性疾病中的应用[17].另外，移植后的MSCs还可以转分化为神经细胞，并分泌各种神经营养因子和抗炎因子，这在肌萎缩侧索硬化、多发性硬化和青光眼模型等神经性疾病中具有很强的神经保护作用[18].虽然已经有很多关于MSCs的各种功能的报道，但是对其潜在的机制还不完全了解,人们普遍认为细胞分泌的膜结合因子和可溶性因子起了更重要的作用.

2 外泌体的生物发生及功能

外泌体是通过特定的细胞内途径形成的，包括早期内体的内陷而产生小的腔内囊泡[19]，这些囊泡成熟后成为多囊体(MVBs).在外泌体生物发生过程中(图1a)，MVBs有两条不同的路径:MVBs的内含物既可以被降解，也可以被释放到细胞外环境中.当蛋白质成为溶酶体降解的目标时，MVBs与溶酶体膜融合，导致溶酶体中的腔内囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)降解[20].另外，MVBs可以与质膜融合，并以外泌体的形式从细胞中释放ILVs(图1b).外泌体所包含的一些细胞因子，例如TSG101(肿瘤易感基因101)和Alix (ALG-2相互作用蛋白X)的ESCRT组分或鞘脂神经酰胺，在控制蛋白质分选过程中发挥其积极作用[21].外泌体最独特的功能可能是与靶向受体细胞的特异性相互作用，这可以使体内相距较远的细胞进行信号通信.来自不同细胞的外泌体参与了重要的病理和生理过程,如处理不需要的蛋白质,呈递抗原,基因交换,免疫反应,血管增生, 炎症、肿瘤转移和病原体或癌基因的扩散,这些功能都依赖于外泌体中包含的成分，特别是蛋白质和RNA.

(a)外泌体的生物合成及释放 (b)外泌体的组成成分及生物标志物

外泌体具有以下功能: 1)介导生物学效应, 主要通过其特异miRNA,调控细胞的生长和凋亡, 具有神经保护性.科学家通过测序发现,人神经干细胞外泌体有113种miRNAs, 结果显示, hsa-miR-1246、hsa-miR-4488、hsa-miR-4508、hsa-miR-4492和hsa-miR-4516等5种miRNAs表达量较高, 其中hsa-miR-1246是一种靶向p53的miRNA，在调节细胞生长和凋亡中发挥重要作用.此外, 其他研究显示, miR-21a、miR-125b在外泌体中高表达, 能够促进神经细胞的分化和再生[22-23].2)介导MSCs与微环境的通讯.COSSETTI等[24]通过研究发现, 外泌体介导小鼠MSCs与微环境之间的通讯, 促炎因子激活MSCs中的干扰素-γ(interferon gamma, IFN-γ)信号转导通路, 导致IFN-γ途径的特定成分通过外泌体作用于靶细胞.3)通过非受体的方式介导病毒进入细胞. 4)可以作为独立的代谢单元发挥作用, 改变微环境中关键营养素的浓度, 从而影响周围细胞的生理功能[25].

3 MSCs及其分泌的外泌体

3.1 MSCs的局限性

干细胞在治疗几种毁灭性疾病方面有很大的前景.特别是MSCs正在700多项临床试验中进行测试，其中就包括治疗神经退行性疾病[26]， 但是，使用MSCs进行的临床前研究和临床试验产生了不同的结果，部分原因是对其作用机制的理解有限.MSCs领域的一个特殊难题是，在全身移植后，MSCs由于其体积较大，通常只有不到1%的MSCs能到达并植入靶位点，因此很快会被截留在肺血管床中[27].虽然结果表明移植MSCs仍能达到一定的治疗效果[28]，但免疫排斥、细胞去分化、干细胞致瘤、体内特异性归巢、治疗靶点的明确性等问题限制了MSCs在临床上更好的应用.目前的一些研究将MSCs的治疗功能主要归因于其旁分泌因子,其中就包括外泌体(见图2).

3.2 MSCs分泌的外泌体及其优点

外泌体主要通过两种方式用于神经疾病的治疗: MSCs分泌的外泌体富含miR-133b、miR-9、miR-21a等miRNA, 可直接用于治疗疾病; 将特异RNA、蛋白质和小分子药物加载到外泌体中, 用经过修饰的外泌体靶向治疗神经系统疾病.2010年科学家首次在小鼠心肌缺血/再灌注损伤模型中研究了MSCs衍生的外泌体，随后在几种疾病模型中进行了测试[29].测试结果显示，MSCs比其他细胞如成肌细胞等能产生更多的外泌体[30].来源于MSCs的外泌体与其他来源的外泌体在形态特征、分离和储存条件方面没有差异.当从不同批次的MSCs的条件培养基中获得外泌体时，MSCs来源的外泌体中的蛋白质成分并不保持恒定.在三个独立批次的MSCs衍生的外泌体中，通过液相色谱-质谱方法共分别检测到379、432和420种独特的蛋白质，其中只有154种蛋白质是常见且稳定存在于外泌体中的.根据功能对这些蛋白质进行聚类，结果表明，MSCs外泌体具有驱动许多生物过程的潜力.这一概念与已经报道的MSCs治疗多种疾病的疗效一致.另外，体内移植MSCs外泌体还可以可减少细胞凋亡、改变炎症、减少细胞生长并增强心肌活力[31].因此，外泌体的生物利用度和固有的生物学特性使其成为非常有前途的治疗疾病的载体.与治疗性体内外细胞替代灌注相比，外泌体治疗也具有安全性和可调节的优势[32].第一，外泌体不像细胞能进行内生性复制，因此不会转移.第二，外泌体是可以包含人造货物的胆脂囊泡，因此可以通过生物工程进行质量控制，并扩大剂量[33].第三，治疗性的外泌体也可以从患者自身细胞中提取，以减少或消除潜在的免疫并发症.

4 外泌体——神经退行性疾病的纳米治疗剂

4.1外泌体在阿尔茨海默病中的研究与应用

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是发生于老年和老年前期的一种以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变[34].AD是老年期最常见的痴呆类型，占老年期痴呆的50%～70%.尽管AD的具体发病机制仍有待探索，但Aβ淀粉样蛋白在神经元胞外的聚集被认为是AD发病的重要原因之一.Aβ蛋白过度堆积后，可诱导产生对神经元的氧化损伤等慢性损伤，这是引起AD患者认知缺陷逐渐加重的重要原因之一.中枢神经系统疾病的治疗由于存在血脑屏障阻隔，常导致药物难以到达病变部位而影响治疗效果.近年来的研究发现干细胞来源的外泌体可以发挥类似干细胞的功能，对于中枢神经系统，外泌体可以通过血脑屏障的特性赋予其有效治疗神经疾病的独特优势.已经有大量的研究证实，MSCs来源的外泌体具有促进中枢神经系统损伤病灶中的内源神经元及血管内皮细胞再生的作用.MSCs外泌体也被发现对Aβ蛋白所引起的神经元慢性损伤具有一定的保护及促进再生修复的作用,对AD的认知缺陷具有治疗效果.另外，为了解决这种Aβ积累的不平衡，脂肪组织来源的MSCs已被用于分泌含有奈普利赖氨酸的外泌体[35].这种酶能够降解Aβ淀粉样蛋白，从而通过胞外释放奈普利酶，为AD治疗提供了一种潜在的治疗工具.

体外研究发现,MSCs外泌体能够降低AD海马体神经元中与活性氧相关的荧光信号表达,可以保护神经元免受Aβ蛋白诱导氧化损伤[36].Wang等的研究发现MSCs外泌体降低了诱导性一氧化氮合酶( inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)在病变神经元中的过高活性.由于iNOS的过高活性参与了Aβ蛋白诱导的神经元氧化损伤,MSCs外泌体的这种抑制作用能够缓解病变神经元所受到的氧化损伤[37].

除了保护神经元免受Aβ蛋白诱导的氧化损伤,MSCs外泌体还能通过抑制由Aβ蛋白引起的突触蛋白PSD-95减少,保持海马体神经元突触数量稳定并促进突触生长.由于海马体内神经元的突触密度与动物认知功能密切相关,MSCs外泌体的这种促进突触生长作用对改善AD认知缺陷具有重要价值.另外，还有一项研究发现,Aβ蛋白堆积能引起AD转基因小鼠脑内促凋亡因子p53、Bax及 caspase-3的高表达,而抗凋亡因子Bcl-2的表达则降低[38].这种凋亡相关因子的失衡最终导致神经元因凋亡而数量逐渐减少.MSCs外泌体能降低促凋亡因子的高表达,并提高抗凋亡因子的表达.在抑制神经元凋亡的同时,MSCs外泌体还对病变损伤的神经元具有显著的促进其轴突再生的作用,这与MSCs外泌体在缺血或外伤等急性神经损伤中的治疗作用十分类似.通过MSCs外泌体对病变神经元的保护和促进再生修复作用,在AD转基因小鼠体内,MSCs外泌体治疗能显著延缓小鼠的认知功能缺陷的恶化,具有明显的认知功能保护作用.这对减缓AD患者在病程中的生活质量下降将具有重要意义[39].

最近有研究证实,MSCs外泌体对AD具有治疗效果与其所携带的miR-21有关.通过与miR-21-MSCs外泌体在AD转基因小鼠体内的治疗效果进行对比,研究发现,miR-21+MSCs外泌体能够调节促炎-抗炎因子平衡,还能促进神经元突触与轴突生长,而miR-21-MSCs外泌体的这些作用却不明显[40].

4.2 外泌体在帕金森病中的研究与应用

帕金森病(Parkinson Disease，PD)是继阿尔茨海默病的第二大常见中枢系统退行性疾病，主要累及病影响运动神经系统.其在老年人中较为常见，我国65岁以上人群PD的患病率大约为1.7%.这其中大部分患者为散发病例，仅有不到10%的患者有家族史或相关易感基因突变[41].帕金森病因尚未明确，但普遍认为是环境和遗传因素共同导致.其主要病理改变为中脑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元的变性死亡、纹状体DA含量显著性减少以及黑质残存神经元胞质内出现嗜酸性包涵体，即路易小体(Lewy body)出现.目前也有研究发现帕金森病与大脑炎症、小胶质细胞活化和分泌性神经毒性活动有关，包括活性氧(ROS)[42-43].有研究显示,MSCs外泌体所携带的miR-133b起到了关键的促进受损神经元轴突生长作用.神经损伤后激活的炎症反应会对病灶内的神经元形成二次打击与损伤.还有研究发现,脑组织内的促炎因子IL-1β在脑外伤小鼠伤后6～12 h存在一个表达水平高峰,这所引起的强烈急性炎症对早期脆弱的受损神经元会造成再次损伤.而MSCs外泌体能明显抑制该因子在早期神经损伤中的过高表达,形成有利于受损神经元修复的病灶微环境.从PD大脑中提取的样本显示了氧化还原酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶以及其他抗氧化剂水平的降低[44].这可能导致PD患者氧化应激和神经退行性变.在这方面，过氧化氢酶是自然界中最有效的抗氧化剂之一，在一个催化反应循环中，每一个过氧化氢酶分子每秒可以使100万个自由基失效.有研究表明，过氧化氢酶的成功脑传递可能对帕金森病的治疗有帮助.Haney等人发现，过氧化氢酶是帕金森氏病的一种有前途的治疗方法，但是在载有药物的纳米颗粒中不能将其运输穿过血脑屏障存在两个问题，即制剂的纳米毒性和颗粒的活化及吞噬作用的快速清除[45].在帕金森氏小鼠模型中，通过药物负载外泌体获得的催化酶制剂(exoCAT)到达靶神经元并在这些细胞中积累.因此，外泌体的生物利用度和天然的生物学特性使它们成为非常有前途的治疗帕金森疾病的载体.

4.3 外泌体在脊髓损伤疾病中的研究与应用

脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)通常会导致受伤脊髓段以下的肢体产生严重功能障碍，严重的损伤甚至可能是致命的.SCI的最终严重程度既取决于最初的创伤，包括物理性破坏神经元或切断轴突，也取决于炎症引起的延迟性继发性损伤的程度，炎症可导致水肿、神经元凋亡、应激性胶质细胞增生.SCI的治疗正在迅速发展，一些实验性治疗已在临床试验中得到检验.然而，SCI在很大程度上仍然不可逆转，目前还不确定这些疗法是否能安全地改善预后.而外泌体携带参与信号转导的物质,可调节微环境和大脑功能的各个方面.因此,MSCs分泌的外泌体为脊髓损伤的治疗提供了一种新途径.

由于神经元自行再生能力极低，中枢神经系统损伤后的功能障碍往往会伴随患者终身.在SCI的大鼠疾病模型中，通过MSCs外泌体的治疗，发现病灶中的神经元和血管内皮细胞数量显著增加，呈现出活跃的神经及血管再生现象[46-47].

除此之外,MSCs外泌体还能够直接调节中枢神经系统中的多种炎症效应细胞.MSCs外泌体能够降低病灶内星形胶质细胞的NFκBp65表达，并最终抑制星形胶质细胞在SCI后向具有神经毒性的A1表型活化.MSCs外泌体还被发现可以诱导上调小鼠SCI病灶内巨噬细胞M2亚型相关的如Arg1及CD206等mRNA表达,使巨噬细胞倾向于向抑制免疫的M2亚型极化[48].MSCs外泌体通过对免疫反应的调节改善了病灶微环境,减少了过强免疫反应对神经元的损伤,有利于神经修复再生,在中枢神经系统损伤的治疗中具有重要作用.

5 展 望

外泌体具有多种生物学功能,来自干细胞的天然或工程化的外泌体都能提供治疗效果.正在进行的研究将外泌体作为神经性疾病的细胞间通讯手段，这将为外泌体在这些疾病的发病机制发展中的作用提供新的见解，并有助于开发外泌体治疗以促进疾病恢复.干细胞衍生的外泌体在各种神经退行性疾病的动物模型中都有一些令人鼓舞的治疗效果.还有人认为，外泌体是理想的药物递送载体，因为它们封装了多产的蛋白质和RNA，可以穿过质膜将其货物递送到靶点细胞，并被人体很好地耐受.然而，尽管外泌体疗法可能有很多相对于细胞来说明显的优势，但在这些治疗策略能够广泛实施之前，仍有一些障碍有待解决:1)需要确定外泌体的装载能力和内含物的半衰期，以开发用于治疗的工程合成内含物.2)需要对外泌体的剂量进行药理学考虑，并对其在系统使用时的生物分布进行评估,使其符合CGMP(current good manufacture practices)的要求.3)须确定目标细胞外泌体摄取的动力学，以及外泌体药物的治疗传递是否需要泡囊表面的生物工程配体，以提高对选定靶点的传递成功率.

MSCs是外泌体的多产者.而且永生化MSCs细胞系所获得的外泌体与正常MSCs来源的外泌体在质量和数量上基本一致.从而保证了MSCs外泌体生产的可持续性和可重复性.此外,不断积累的实验数据表明，通过对母细胞进行预处理或遗传操作,可以改善外泌体的分泌情况.我们推测来自预处理MSCs的外泌体可以作为药物或基因递送的理想载体,成为新型神经退行性疾病的纳米治疗剂.外泌体作为一种可控、可管理、可行的方法，在未来的研究中将大有可为.