鞣花酸对心肌细胞脂毒性损伤的保护作用及其机制研究*

李梦杰，鲍翠玉，李 晶，刘 涛

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室；3.湖州师范学院；4.湖北科技学院附属第二医院)

脂毒性损伤已经成为一个公共健康问题[1-2]，多项研究表明，如果游离脂肪酸水平较正常值显著升高，心脏组织的脂质沉积会增加[3-4]，导致心肌细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的增加[5]，这种过量的ROS可能会诱发心肌细胞凋亡和相关的心脏并发症。因此，抑制心肌细胞内ROS的升高将是保护心肌免受脂毒性损伤的可行方法。之前的一项关于游离脂肪酸诱导心肌损伤的研究表明，游离脂肪酸能够通过减弱氧化应激有效抑制心肌细胞内ROS的增加，从而防止心肌细胞出现凋亡[6]。考虑到这一点，我们拟使用某些抗氧化剂通过减轻氧化应激来抑制细胞内ROS的增加，避免脂毒性心肌损伤。基于此，本研究中我们使用棕榈酸(palmitic acid，PA)建立心肌细胞脂毒性损伤模型，检测鞣花酸(ellagic acid)对心肌细胞脂毒性损伤的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器

H9C2心肌细胞购自上海通派生物有限公司。DMEM培养基、胎牛血清和胶原酶均购自Gibco；丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒购自Dojindo Molecular Technologies，Inc。ROS测定试剂盒由Applygen Technologies，Inc.提供。磷酸化AMPK(p-AMPK)、总AMPK、p-哺乳动物雷帕霉素复合靶点-1(p-mTORC1)、总mTORC1、p-p70核糖体蛋白S6激酶(p-p70S6K)、总p70S6K和β-actin多克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司。MTT检测试剂盒购自Sigma-Aldrich公司。PA、鞣花酸及其他试剂均购自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT检测细胞增殖

用2.25g/L葡萄糖、10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM，在37℃、5%CO2的培养箱中培养H9C2心肌细胞。将H9C2细胞以1×105细胞/孔的密度接种于96孔板，孵育24h后，细胞分组给药，37℃下进行孵育，孵育结束后每个孔加入MTT，在37℃下孵育4h后丢弃培养基。每个孔加入150μL的DMSO，震荡混匀后，用分光光度计测量570nm处的吸光度。实验重复3次。

1.2.2 ROS水平检测

我们用Dihydroethidium(DHE)(ex=535nm，em=610nm)检测细胞内超氧化物阴离子。H9C2细胞接种于6孔板(2×104个细胞/孔)中，培养24h，细胞贴壁后，分组给药，即分别在37℃暴露于PA(0.2mmol/L)或PA(0.2mmol/L)+鞣花酸(1、20、100μmol/L)中孵育24h。然后用冷PBS洗涤细胞，在37℃下，细胞加入DAPI孵育20min，进行细胞核染色，荧光显微镜用于观察荧光信号的强度。实验重复3次。

1.2.3 主要生化指标的测定

MDA属于细胞内氧化应激水平的评价指标，SOD属于细胞内氧化应激衰减程度的评价指标。为了检测两个指标的变化，将H9C2细胞分为不同给药组孵育24h，即PA(0.2mmol/L)或PA(0.2mmol/L)+鞣花酸(1、20、100μmol/L)。孵育结束后，细胞用RIPA裂解缓冲液裂解，4℃离心收集上清，检测蛋白含量。取100μL的上清，加入200μL的MDA测试溶液，混合后煮沸15min，冷却至室温，在4℃，12 000g离心10min。在96孔板上加入200μL上清液，使用酶标仪测定532nm处的吸光度。实验重复3次。

另一组实验中，为了检测SOD，将分组给药的细胞均质化，并将所得匀浆在4℃离心收集上清，检测蛋白含量。向离心管中添加20μL上清液和160μL NBT/酶工作液，并在4℃下孵育5min。然后将混合物加入20μL的反应起始工作液中，在37℃下孵育30min。使用上述相同的酶标仪检测560nm处吸光度。实验重复3次。

1.2.4 免疫印迹法检测蛋白表达

将培养24h的H9C2细胞分为不同给药组，即PA(0.2mmol/L)或PA(0.2mmol/L)+鞣花酸(1、20、100μmol/L)，然后用RIPA裂解缓冲液裂解30min，在4℃离心收集上清，检测蛋白含量。用SDS-PAGE(8%～12%)进行蛋白的电泳分离，并转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭1h后，加入以下抗体进行孵育(均以1∶1 000稀释)：p-AMPK(#2535)，AMPK(#5831)，p-mTORC1(#5536)，mTORC1(#2972)，p-p70S6K(#9209)，p70S6K(#9202)和β-actin(#4970)。一抗孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶连接的兔抗鼠IgG(ab6728；1∶2 000，Abcam)室温下孵育2h。最后，用ECL化学发光系统对蛋白进行显影，并用图像分析软件(GeneTools；SynGene)进行定量分析。实验重复3次。

1.3 统计学方法

GraphPad Prism v5软件中单向方差分析和Tukey检验用于统计学分析，P<0.05被认为是有统计学差异。

2 结 果

2.1 鞣花酸对PA诱发的H9C2细胞增殖损伤的影响

将不同浓度的PA与H9C2细胞孵育，通过测量细胞增殖来观察PA诱导的细胞脂毒性损伤，结果如图1A和B所示。当PA浓度>0.1mmol/L时，或当PA刺激时间>24h时，细胞增殖能力均开始急剧下降。这些数据表明，当PA浓度或刺激时间超过一定阈值时，PA会导致心肌细胞出现损伤。基于这些结果，我们认为将PA浓度设为0.2mmol/L，刺激时间设为24h，可以成功建立PA诱导的心肌细胞损伤模型，以供后续实验使用。图1C说明，鞣花酸能够有效地抵抗PA诱导的细胞损伤，与PA组相比，PA+鞣花酸组细胞增殖率出现随鞣花酸浓度依赖性上升趋势，尤其在鞣花酸浓度为20μmol/L以上时开始差异显著(P<0.01)。可见，鞣花酸可以有效阻断PA诱发的心肌细胞增殖能力的损伤。

2.2 鞣花酸对PA诱发的细胞ROS水平、MDA含量和SOD活性的影响

使用DHE作为荧光探针检测PA诱导的ROS水平，如图2(封二)所示，与对照组相比，PA给药组细胞显示更强的红色荧光，这意味着PA可以诱发细胞内ROS水平显著的升高。另一方面，与PA组相比，PA+鞣花酸组细胞内红色荧光出现明显的降低，表明鞣花酸可以阻止细胞内ROS的产生，如图3A所示，表明鞣花酸可以显著抑制PA诱发的ROS水平升高(P<0.05)。图3B、3C表明，PA诱发细胞内MDA的大量增加，同时导致SOD活性显著降低(P<0.05)，并且这种变化与细胞内氧化应激水平的升高密切相关。与这些观察结果相反，20μmol/L鞣花酸可以显著抑制MDA的增加，调节SOD活性，使这两个典型指标恢复到正常细胞水平。

与control组比较，*P<0.05；与PA组比较，#P<0.05(n=3)

2.3 鞣花酸保护心肌细胞免受PA脂毒性损伤的可能机制

AMPK通路在调节细胞存活、氧化应激和凋亡中起着重要作用。我们用免疫印迹法分别检测了细胞中AMPK和p-AMPK以及关键下游蛋白(p-mTORC1和p-p70S6K)的表达水平。如图4A所示，与对照组相比，PA组p-AMPK明显降低，p-mTORC1和p-p70S6K明显增加，而三个蛋白的总蛋白表达无显著改变；另一方面，PA+鞣花酸组p-AMPK、p-mTORC1和p-p70S6K均恢复到对照组水平。图4B数据表明，鞣花酸能够抵消PA所致p-AMPK、p-mTORC1和p-p70S6K水平的异常变化。以上结果提示，鞣花酸可通过AMPK途径保护心肌细胞免受脂毒性损伤。

与control组比较，*P<0.05；与PA组比较，#P<0.05(n=3)

3 讨 论

心肌梗死是一种急性的致命性的心脏病[7]，高脂血症通过促进心脏过度氧化应激的诱发，参与了高脂致心脏损伤的发病过程，进而导致心肌细胞出现凋亡。高脂血症与ROS的过度生成和抗氧化防御系统的受损密切相关[6]，ROS生成和ROS清除系统之间平衡的破坏将使细胞内的超氧离子过度积累，导致细胞出现功能障碍和损伤。鉴于此，目前各种类型的抗氧化剂在治疗高脂血症方面被广泛研究[8]。鞣花酸属于一种天然的抗氧化保护剂[9]，它可以消除过量的ROS，增强抗氧化防御能力[10-11]。在本研究中，PA可以明显增加心肌细胞内的氧化应激产物ROS及MDA的水平，并明显降低心肌细胞内抗氧化应激超氧化物歧化酶SOD的水平，而鞣花酸能显著阻断PA所致心肌细胞内ROS、MDA及SOD的变化。另一组数据证实，PA明显降低心肌细胞增殖率，预处理鞣花酸明显改善PA所致心肌细胞增殖下降。以上数据说明，鞣花酸可以明显抑制PA所致心肌细胞氧化应激损伤。

高脂血症的发生与多种因素有关[12]，这些因素包括NADPH氧化酶产生超氧物、氧化磷酸化、蛋白激酶C水平异常、多元醇激活和己糖胺途径。研究表明[6]，AMPK通路在调节高脂血症并发症的发生发展中起着关键作用。众所周知，AMPK是一种关键的细胞内蛋白激酶[13-15]，它不仅可以调节涉及脂肪酸和葡萄糖的细胞代谢，还可以调节抗凋亡过程。激活AMPK可以防止PA诱发内皮细胞线粒体断裂和功能障碍。基于这些研究结果，本研究旨在探讨AMPK通路与心肌细胞脂毒性损伤的关系，并探讨鞣花酸是否也能通过激活AMPK保护心肌细胞免受脂毒性损伤。本研究中，PA可以明显降低心肌细胞内p-AMPK，增加p-mTORC1和p-p70S6K水平，而预处理鞣花酸组，p-AMPK、p-mTORC1和p-p70S6K均可以恢复到对照组水平。这个数据说明，鞣花酸能够通过激活p-AMPK升高到正常水平来抑制p-mTORC1和p-p70S6K，从而保护心肌细胞免受PA的脂毒性损伤。

综上所述，鞣花酸能够抑制PA诱导的心肌细胞氧化应激损伤，同时通过激活p-AMPK，降低p-mTORC1和p-p70S6K的表达，参与心肌细胞抗脂毒性损伤的作用过程，从而证实了鞣花酸具有预防心肌脂质毒性损伤的潜力。本研究主要集中在体外实验的各种检测，在下一步研究中，我们将用体内实验进一步证明鞣花酸对心肌的保护作用。