外周血microRNA-199a水平与特发性肺动脉高压预后的相关性

宋玮 齐咏 陈卓昌

(河南省人民医院呼吸与危重症医学科，河南 郑州 450000)

特发性肺动脉高压(idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH)是肺动脉高压中的一种特殊类型，是以不明原因的肺小动脉管壁增殖性改变为主要病理特征，进而引起肺动脉血管阻力增加、血流受限并最终导致右心功能不全的临床综合征[1-2]。一组基于中国人的调查显示，IPAH患者经常规治疗后5年生存率为20.8%[3]。目前临床上仍缺乏预测IPAH疾病严重程度和预后的特异性强的分子标志物。报道显示，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)参与调节IPAH发展进程，可能成为IPAH防治的新的潜在标志物[4]。相关研究[5]表明，miRNA-199a在肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)增殖调控中具有明确的作用。因此，本研究通过分析外周血miRNA-199a在IPAH患者中的表达水平，探讨其与IPAH预后的相关性，旨在为IPAH的预后预测寻找可靠的分子标志物。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2015年11月—2017年11月河南省人民医院收治的42例IPAH患者(IPAH组)。纳入标准：(1)符合IPAH诊断标准，静息状态肺动脉平均压(mean pulmonary artery pressure,mPAP)≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)，并排除其他病因；(2)年龄≥18岁；(3)本研究取得患者知情同意并经医院伦理委员会通过。排除标准：(1)合并肿瘤、严重的肝肾疾病或全身代谢性疾病者；(2)有心肌梗死、肺梗死或脑梗死史者；(3)合并其他系统疾病导致无法配合完成心导管检查者。42例IPAH患者中，女性27例，男性15例；年龄21～64岁[(36.64±6.20)岁]。另选取同期性别、年龄与IPAH组患者相匹配的健康体检者40例作为正常对照组。所有患者入院后采集空腹静脉血5 mL，离心后分离血浆，并于-80 ℃条件下保存。对IPAH患者随访观察2年，随访以电话及门诊方式进行，记录患者随访期内生存情况。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)于罗氏cobas z480全自动荧光定量PCR分析仪进行，miRNA提取试剂盒由德国Qiagen生产。

1.2.2 miRNA的提取

冷冻血浆标本融化后，将1 mL总提取液加入到300 μL血清样本中，根据miRNeasy血浆提取试剂盒操作说明从血浆样本中提取总RNA。

1.2.3 miRNA逆转录及RT-PCR检测

以U6作为实验内参，逆转录反应体系：5 μL RNA模板，3 μL U6及miRNA-199a引物，0.15 μL 100 mmol/L dNTPs，1.00 μL逆转录酶，1.5 μL 10×反转录缓冲液，0.19 μL RNase抑制剂，4.16 μL无菌三蒸水；逆转录反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。扩增反应体系为20 μL：1.00 μL TaqMan Small RNA Assay(20×)溶液，10.00 μL TaqMan®Universal PCR Master Mix Ⅱ(2×)溶液，1.33 μL cDNA，7.67 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水。扩增条件：95 ℃ 10 min为一个循环，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min进行40个循环，重复3次。以2-ΔΔCt法计算miRNA-199a的相对表达水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 两组一般资料及IPAH组心导管检查结果

两组性别、年龄和身体质量指数比较无显著差异(P>0.05)。IPAH组心导管检查结果详见表1。

表1 两组患者一般资料及IPAH组心导管检查结果

2.2 外周血miRNA-199a在IPAH组和对照组表达水平比较

IPAH组外周血miRNA-199a水平显著低于对照组，差异有统计学意义(t=12.359，P<0.05)，见图1。

注：与对照组比较，*表示P<0.05。图1 外周血miRNA-199a在IPAH组和对照组表达比较

2.3 IPAH患者外周血miRNA-199a表达水平与mPAP、肺血管阻力和肺血管阻力指数的相关性分析

采用Pearson相关分析IPAH患者外周血miRNA-199a表达水平与mPAP、肺血管阻力(total pulmonary vascular resistance，PVR)和肺血管阻力指数(pulmonary vascular resistance index，PVRi)的相关性，结果显示外周血miRNA-199a表达水平与mPAP、PVR和PVRi均呈显著负相关(r=-0.509，P<0.05；r=-0.637，P<0.05；r=-0.591，P<0.05)。见图2。

图2 IPAH患者外周血miRNA-199a表达水平与mPAP、PVR和PVRi的关系

2.4 外周血miRNA-199a表达水平与IPAH患者预后的关系

2.4.1 不同预后IPAH患者外周血miRNA-199a表达水平比较

截止随访时间，42例IPAH患者均获得完整随访，其中12例(28.57%)因心功能不全死亡。据随访结局，将IPAH患者分为生存组与死亡组，死亡组外周血miRNA-199a表达水平显著低于生存组(P<0.05)，见表2。

表2 不同结局IPAH患者外周血miRNA-199a表达水平比较

2.4.2 外周血miRNA-199a预测IPAH患者预后的ROC曲线分析

绘制外周血miRNA-199a预测IPAH患者预后的ROC曲线，取约登指数最大时对应的miRNA-199a水平作为最佳临界值，结果显示外周血miRNA-199a预测IPAH预后不良的最佳截断值为1.36，预测的AUC为0.834(95%CI0.734～0.908)，与AUC=0.5比较，差异有统计学意义(Z=6.430，P<0.05)。见表3和图3。

表3 外周血miRNA-199a预测IPAH患者预后的预测效能

图3 外周血miRNA-199a预测IPAH患者预后的ROC曲线

3 讨论

近年来报道[6]显示，循环血miRNA水平变化与众多疾病联系紧密，有潜力作为疾病早期诊断和预后评估的生物标志物。研究发现miRNA与肺动脉高压的疾病进程密切关联[7-8]。此外，血液中的miRNA不易被降解，相关报道[9]指出细胞中的miRNA能以微泡、外来体和凋亡小体等形式分泌入血，从而逃避血浆RNA消化酶对其进行消化降解，同时伴随着微量miRNA提取技术的快速进展，也使得血浆miRNA可能作为判断IPAH预后的潜在分子标志物。

报道指出，在肺动脉高压和癌症的致病机制中存在相似的细胞过度增殖和迁移的相关病理机制[10-12]。研究[13]显示，miRNA-199a参与肿瘤疾病进程中的细胞增殖与迁移的调控，但目前miRNA-199a在IPAH中的作用尚不完全清楚。本组病例中，IPAH组miRNA-199a水平较正常对照组显著下调，提示miRNA-199a可能与IPAH病程密切相关。右心导管检查是临床上IPAH诊断的“金标准”，本研究中，IPAH患者入院后右心导管检查均提示患者存在严重的血流动力学障碍，表现为mPAP、PVR和PVRi等参数均异常升高。通过相关性分析，笔者发现miRNA-199a水平与mPAP、PVR和PVRi呈显著负相关，说明miRNA-199a与IPAH病情严重程度间存在着密切关联。Yang等[14]采用缺氧条件培养大鼠PASMCs，结果显示miRNA-199a表达水平在大鼠PASMCs中显著下调了约85%，通过过表达miRNA-199a可显著降低缺氧诱导的PASMCs增殖，从而增加其凋亡；而敲除miRNA-199a可增加PASMCs的增殖和减少其凋亡。结合Yang等[14]研究，笔者推测IPAH患者外周血miRNA-199a下调可能反映了IPAH患者PASMCs内miRNA的表达变化，并通过相关信号通路调控PASMCs增殖和凋亡的形式参与IPAH疾病进程，但具体的信号转导机制有待后续研究进一步明确。IPAH好发于女性患者，并且预后较差，患者多因进行性的右心功能不全而致右心衰竭死亡。本研究中IPAH患者发病特征与以往报道[15]的IPAH人口学特征相符，另外通过分析外周血miRNA-199a表达水平与IPAH患者预后的关系发现，低外周血miRNA-199a表达水平提示IPAH预后差。ROC曲线分析显示，外周血miRNA-199a预测IPAH预后不良的最佳截断值为1.36，预测的AUC为0.834(95%CI0.734～0.908)，提示其对IPAH患者预后具有较好的预测价值。

综上所述，本研究结果表明外周血miRNA-199a表达水平在IPAH患者明显下调，其能较好地预测IPAH患者预后，可能是IPAH预后预测的潜在分子标志物。