党武辣椒快繁技术体系的优化

钟兴菊， 刘红美， 曾丽娜， 刘利利

(贵州医科大学 生物与工程学院， 贵州 贵阳 550025)

0 引言

【研究意义】辣椒(CapsicumannuumL.)属于茄科作物，在人类生产和生活中占有重要地位[1]，中国是世界第一大辣椒生产国与消费国[2]。近年来，贵州省作为中国辣椒的重要产区，将辣椒作为12个特色优势产业之一进行打造[3]，贵州已成为我国辣椒种植面积最大的省份，因此可以说辣椒是贵州最具代表性的传统特色优势产业[4-5]。保证种苗质量和数量的充足供应，对发展辣椒产业至关重要，因此针对不同辣椒品种开展快速繁育体系研究具有重要的现实意义。【前人研究进展】贵州省以山地、丘陵为主，这两类地形面积占全省总面积的92.5%，地域环境变化导致地方自有辣椒品种种性退化[6]。为保持优良品种的纯度，提高其种性，防止品种退化，更好地发挥种质优势的作用，急需对品种进行提纯复壮[7]。组培快繁技术可避免常规的系统选育方法周期长、受不良因素影响大、品质不稳定等缺点[8]，故采用组培快繁技术对辣椒提纯复壮，是实现辣椒改良的有效方法之一[9]。【研究切入点】党武辣椒作为贵州省贵安新区地方品种，是长期人工选择与自然选择的产物，含有丰富的基因型。由于党武辣椒经过长期的自然杂交、机械混杂等[10]，品质上出现明显分化，病虫害比较严重，加之农户的种植方式粗放，产量与品质逐年降低。在对辣椒再生体系的研究中，激素配比、基因型及外植体类型对辣椒快繁再生具有重要影响[11]，亟待一套适合当地辣椒发展的优质繁育体系。【拟解决的关键问题】通过对党武辣椒去顶芽子叶的侧芽分化离体培养快速繁育，筛选不同的消毒方法、外植体、植物生长调节剂及培养条件等，建立一套适合党武辣椒快速繁育的技术体系，为党武辣椒优质种苗生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

党武辣椒种子采自贵州省贵安新区党武镇党武辣椒种植区，试验种子发芽率在93%以上。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗的获取 将种子放入培养瓶并滴入3 mL洗洁精，加入无菌水摇洗10 min，自来水流水冲洗1.5～2 h；将种子沥干水分，倒入75%酒精摇洗30 s，无菌水清洗2次，再加3%次氯酸钠溶液摇洗10 min，无菌水清洗5次，接种于1/2 MS培养基上(1/2 MS +蔗糖30 g/L +琼脂8 g/L，pH 5.95～6.05)培养，放入培养室培养，培养条件为每天16 h光照，光照强度为2 500 lx[12]，温度为25℃，10 d后统计发芽率。

1.2.2 外植体选择 选取外植体为去掉顶芽且带有叶片(叶片留0.1～0.3 cm)的茎尖段(1 cm)[13]。

1.2.3 侧芽分化培养基激素种类、苗龄与生长调节剂浓度的筛选 以MS为基本培养基，在此基础上通过添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、硝酸银(AgNO3)6种不同类型生长调节剂(表1)和不同激素配比进行侧芽分化试验(表2)，以芽分化率和分化倍数为参考指标，筛选出适合党武辣椒侧芽分化的激素和生长调节剂的配比；用初筛效果较好的用于愈伤组织途径的2个配方和直接成苗途径的1个配方再分别对15～30 d不同苗龄的外植体进行外植体苗龄梯度分化试验；依据激素调控模式原理，通过微调低NAA浓度与调高6-BA浓度进行优化试验，筛选最佳配比浓度的生长调节剂。以上所有培养基均附加蔗糖 30 g/L +琼脂 8 g/L(pH 5.95～6.10)。25 d后统计分化率。

表1 侧芽分化培养基的植物生长调节剂组合

表2 侧芽分化培养基组合

1.2.4 生根配方筛选 选择愈伤诱导途径中生长良好的1～2 cm苗[14]，以MS为基本培养基，在此基础上添加0.01～0.5 mg/L不同浓度的NAA，15 d统计生根率，筛选出最佳生根配方。

1.2.5 驯化移栽 愈伤途径中15～20 d的生根壮苗到苗高2 cm及以上后驯化移栽；直接成苗途径中，选择侧芽分化生长良好的苗，待生根幼苗长出白色壮根[15]且达1 cm左右即可，揭开封口膜于培养室内(25℃，2 500 lx)炼苗2～3 d，移栽到营养土(草炭土和珍珠岩[16-17]按体积比4︰1比例混合)中。

2 结果与分析

2.1 侧芽分化培养基的最优植物生长调节剂

由表3可见，试验组2、试验组3、试验组5的分化率和分化倍数较高，NAA和6-BA搭配是适宜于党武辣椒的最佳激素组合。试验组2(NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)可直接促进侧芽分化与生根，未发生愈伤组织，直接先分化出芽再长出根，苗生长绿色粗壮，但出根12 d后出现白化现象，7 d左右出现白化现象的苗有转绿现象，但其转绿后的生长效果不及未白化的苗。2,4-D、GA3对党武辣椒的诱导效果较NAA、6-BA差；试验组6、试验组7中的IAA浓度不适用；试验组5中GA3生长绿点效果较IAA的差。

表3 不同试验组的侧芽分化情况

2.2 不同激素配比的最优侧芽分化培养基

由表4可知，初筛试验取苗龄15 d的外植体，侧芽分化率最高的2种激素配比是0.1 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA 。试验组的平均分化倍数为0.36，各试验组均长出不同程度的愈伤组织(试验组6=试验组7>试验组8=试验组9>试验组5>试验组2=试验组3>试验组1>试验组4)，其中试验组1和试验组4长出的分化芽粗壮绿色；试验组6、试验组7最先出现明显的膨大愈伤，但后期出现较严重的褐化现象；试验组8、试验组9的愈伤组织结构疏松、颜色浅而透明，质地良好，但侧芽分化效果不佳。

表4 NAA和6-BA不同配比的侧芽分化程度

2.3 侧芽分化的最佳苗龄和生长调节剂浓度

选取15 d、20 d、25 d、30 d共4个梯度苗龄的外植体，选用筛选的适合愈伤诱导途径最佳的2个激素配比0.1 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA，与直接成苗途径0.05 mg/L NAA +0.5 mg/L 6-BA 进行试验。从表5看出，党武辣椒侧芽分化的最适苗龄为25～30 d，其中30 d苗龄在0.05 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA 培养基上芽分化率为186%，分化效果最佳，愈伤出现不明显；25～30 d苗龄的平均分化倍数为1.28，是15 d苗龄初筛试验的3.56倍。

表5 不同苗龄与激素比的侧芽分化情况

2.4 25 d、30 d苗龄下侧芽培养基的最佳生长调节剂浓度

从表6可见，愈伤途径分化芽6-BA的最佳浓度为5.0 mg/L，30 d苗龄的外植体分化率优于25 d，因在达到快繁效果的同时也需考虑辣椒脱毒效果，故选取25～30 d的苗较佳；0.07 mg/L NAA 的愈伤分化效果较0.05 mg/L优，但0.05 mg/L NAA的侧芽分化生长效果较mg/L NAA 0.07 优。由此表明，25～30 d苗龄、培养基条件为0.05～0.07 mg/L NAA +5.0 mg/L 6-BA是党武辣椒侧芽分化的最佳培养基浓度配比。

表6 25 d、30 d苗龄下不同激素比的侧芽分化情况

2.5 不同浓度NAA诱导愈伤成苗的生根效果

不同浓度NAA诱导，9 d可见有根生长。从诱导率及苗的整体生长状态(表7)对比看，0.01～0.05 mg/L NAA是诱导根的最佳的NAA浓度；0.1 mg/L NAA组的叶子生长状态良好，但诱导率不高；0.5 mg/L NAA组的幼苗叶子出现枯黄状态，且生长状态不佳。表明，党武辣椒根的最佳诱导浓度为0.01～0.05 mg/L NAA。

表7 NAA不同浓度诱导愈伤成苗根的生长情况

2.6 驯化移栽的存活率

愈伤途径、直接成苗途径生长良好的苗驯化2～3 d进行移栽，12 d后的存活率大于95%。

3 讨论

3.1 辣椒外植体选择与诱导分化

试验选取去掉顶芽且带有叶片的茎尖段，优点在于去除顶端优势的外植体可更好地进行光合作用，利用子叶叶柄的侧芽获得更佳的侧芽分化效果。苏荣存等[18]对韩国的优良辣椒砧木骄珍108的研究中，种子发芽率达70%左右；许多研究选取的辣椒外植体有下胚轴[12-13,19-20]、子叶[21]、带生长点的茎尖[22-24]和花药[25]等，选取胚根[19]作为外植体的研究鲜有报道。张茹等[12，26]研究表明，在选择的外植体中，诱导率依次为带子叶叶柄的芽>子叶芽>下胚轴。

3.2 不同培养基与诱导分化

辣椒植物组织培养几乎以MS培养基为主，运用激素调控模式原理，根据培养目的进行愈伤诱导或诱导分化直接成苗，6-BA在一定范围内(0～5 mg/L)，浓度越大越有利于诱导分化[22]，再配以其他植物调节剂NAA、TAA等效果更好。在筛选适合党武辣椒侧芽分化的植物生长调节剂类型和优化试验中发现，0.05 mg/L NAA +0.5 mg/L 6-BA 可将党武辣椒直接分化成苗；0.05～0.07 mg/L NAA +5.0 mg/L 6-BA 是对党武辣椒进行愈伤诱导的最适配比。该结果与前人研究结果有所差异：覃芳[13]以子叶和下胚轴为外植体，筛选出最佳诱导出芽的激素配方是0.8 mg/L NAA +3 mg/L 6-BA ；柳建军等[15]以下胚轴、子叶、带柄子叶为外植体，得出5 mg/L 6-BA+0.5～1 mg/L IAA + 4 mg/L AgNO3为分化频率最高的配方；龙凤等[26]得出5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA为芽诱导分化的最佳激素组合。而肖英等[24]研究认为，IAA较适于辣椒生长点的转绿成活，同时愈伤途径分化芽6-BA的最佳浓度为5.0 mg/L。

直接成苗途径中，生根12 d左右会出现白化现象，虽然7 d后白化有所转绿，但整体上影响快繁技术的成功率。该途径从育苗到生根整个快繁过程周期需50 d；愈伤途径整个快繁周期需70 d。

3.3 不同苗龄与诱导分化

苗龄是辣椒外植体形成不定芽的一个重要因素[27]，一般认为辣椒离体培养的最佳苗龄在12～15 d，这样可获得较好的茎尖脱毒和分化效果[10]。经4个苗龄梯度试验得出，25～30 d苗龄较适合党武辣椒的快繁技术体系培养。

4 结论

通过党武辣椒侧芽分化快繁技术体系优化试验表明，分化效果最佳的苗龄是25～30 d；直接分化出芽和根成苗途径的最佳培养基是MS +0.05 mg/L NAA +0.5 mg/L 6-BA +30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂 (pH 5.95～6.05)，分化倍数可达1.86倍；MS +0.05～0.07 mg/L NAA +5.0 mg/L 6-BA +30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂 (pH 5.95～6.05)是愈伤经分化芽再长根的最佳培养基，分化倍数可达2倍以上；最佳生根培养基激素浓度为0.01～0.05 mg/L NAA ，根长而粗壮，苗生长状态良好。