猪TNF-α高效表达及其多克隆抗体的制备

黄茂发，梁晶晶，赵祥秀，唐榕泽，高跃美，张文，罗廷荣，李晓宁

摘要：【目的】明确猪源肿瘤坏死因子α（TNF-α）多克隆抗体的特异性和反应性，并探索猪瘟病毒（CSFV）感染对PK-15细胞分泌TNF-α的影响，为揭示CSFV的致病机理打下基础。【方法】提取CSFV病料基因组RNA，通过RT-PCR扩增TNF-α基因，构建原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α并转化BL21感受态细胞诱导表达融合蛋白，经纯化和浓缩后免疫SPF级昆明小鼠制备TNF-α多克隆抗体;同时构建真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α，分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞表达融合蛋白，通过Western blotting、ELISA和间接免疫荧光分析等方法检测TNF-α多克隆抗体效价、反应性及特异性。【结果】以原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α转化BL21感受态细胞，经IPTG诱导后能表达出约43 kD的融合蛋白，且主要以包涵体形式进行表达。以真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染HEK-293T细胞可表达出25 kD的融合蛋白，主要在细胞质中表达，且均匀分布。制备获得的TNF-α多克隆抗体能与转染HEK-293T细胞表达的融合蛋白TNF-α及PK-15细胞的内源蛋白TNF-α发生良好反应，即具有较好的反应特异性，其抗体效价高达1∶8000。CSFV能刺激PK-15细胞分泌蛋白TNF-α上調表达，且TNF-α与其下游因子（TRAF1）的表达变化趋势基本一致，即二者间存在一定关联性。【结论】制备获得的TNF-α蛋白抗体具有效价高、反应性好及特异性强的特点，可用于检测CSFV感染后真核细胞中过表达的TNF-α水平。TNF-α可刺激TRAF1产生，参与TRAF1相关信号通路而发挥其生物学功能，CSFV感染PK-15细胞后TNF-α和TRAF1的表达变化趋势基本一致，说明CSFV能刺激TNF-α和TRAF1信号通路，使机体产生炎症反应。

关键词： 猪;肿瘤坏死因子α（TNF-α）;多克隆抗体;猪瘟病毒（CSFV）

中图分类号： S852.651                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）09-2572-10

Porcine TNF-α high level expression and preparation

of its polyclonal antibody

HUANG Mao-fa1，2， LIANG Jing-jing1，2， ZHAO Xiang-xiu1，2， TANG Rong-ze1，2，

GAO Yue-mei1，2， ZHANG Wen1，2， LUO Ting-rong1，2*， LI Xiao-ning1，2*

（1College of Animal Science and Veterinary Medicine，Guangxi University， Nanning  530004， China; 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Nanning  530004， China）

Abstract：【Objective】To determine the specificity and reactivity of porcine tumor necrosisfactor α（TNF-α） polyclonal antibody，and the effects of CSFV infection on TNF-α secretion of PK-15 cells were investigated，to lay a foundation for revealing the pathogenic mechanism of classical swine fever virus（CSFV）. 【Method】The TNF-α gene was amplified by RT-PCR using RNA template extracted from CSFV infected PK-15 cells，to construct prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-TNF-α and transform BL21 competent cells to induce the expression of fusion protein. Purified and concentrated SPF level Kunming mice were immunized with TNF-α polyclonal antibody. At the same time，eukaryotic expression vector pcDNA3.0-TNF-α was constructed and transfected into HEK-293T cell and PK-15 cell to express TNF-α. Titer，reactivity and specificity of TNF-α polyclonal antibody was detected by Western blotting，ELISA andindirect immunofluorescence methods. 【Result】Prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-TNF-α transformed BL21 competent cells could express about 43 kD fusion protein induced by IPTG，and it was mainly expressed in the form of inclusion body. The eukaryotic expression vector pcDNA3.0-TNF-α transfected HEK-293T cells could express 25 kD fusion protein，which was mainly expressed in cytoplasm and evenly distributed. The prepared TNF-α polyclonal antibody could react well with the fusion protein TNF-α expressed in HEK-293T cells and the endogenous protein TNF-α in PK-15 cells，and had a good reaction specificity and the antibody titer was as high as 1∶8000. CSFV could up-regulate the expression of TNF-α secreted by PK-15 cells. The expression trend of TNF-α and its downstream factor （TRAF1） was basically consistent，therewas certain correlation between them. 【Conclusion】The TNF-α protein antibody has the characteristics of high effective valence，good reactivity and strong specificity，it can be used to detect the overexpression of TNF-α level in eukaryotic cells after CSFV infection. TNF-α can stimulate TRAF1 production and participate in TRAF1-related signaling pathway to play its biological function. The expression of TNF-α and TRAF1 is similar after CSFV infected PK-15 cells. These results suggest that CSFV can stimulate TNF-α and TRAF1 signaling pathways，and leads to the inflammatory reaction.

Key words： porcine; tumor necrosis factor α（TNF-α）; polyclonal antibody; classical swine fever virus（CSFV）

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0500104）; Guangxi Natural Science Foundation（2018GXNSFBA281170）

0 引言

【研究意义】肿瘤坏死因子是由活化的巨噬或单核细胞产生的炎症因子，对肿瘤细胞具有很强的抑制作用，能促进中性粒细胞吞噬，抵抗细菌和病毒感染，参与自身免疫性疾病的病理损伤，从而引起发热症状（吕志敢和郭政，2006;Kalliolias and Ivashkiv，2016）。肿瘤坏死因子分为TNF-α和TNF-β，二者均有致热性，小剂量分泌呈单峰热，大剂量则产生双峰热，不耐热，70 ℃作用30 min即失去活性。TNF-α是由巨噬细胞产生的小分子蛋白，对于肿瘤细胞具有很强杀伤作用，而对正常细胞无毒性，是至今为止医学界发现抗肿瘤活性最强的细胞因子（李蕊蕊等，2018;苏韫等，2018）。TNF-α又称恶液素，可诱发机体发生恶液质（Amber et al.，2015），少量TNF-α具有杀灭癌细胞的作用，过量则无效或造成机体器官坏死。TNF-α还参与机体的炎症反应，是多种信号通路的关键因子。因此，开展TNF-α与猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）感染的相关性研究，对揭示CSFV的致病机理具有重要意义。【前人研究进展】TNF-α存在2种生物活性形式，即跨膜TNF-α（tmTNF-α）和可溶性TNF-α（sTNF-α），最初作为一种25 kD的跨膜蛋白，可被TNF-α转换酶分裂，释放出1个17 kD的可溶性分子（Cruceriu et al.，2020）。tmTNF-α和sTNF-α需通过对应的受体——肿瘤坏死因子受体（TNFR1和TNFR2）才能发挥生物活性作用，其中TNFR1在几乎所有的细胞类型上均有表达，被认为是机体内经典TNF-α功能的主要介质，而TNFR2的表达仅限于免疫细胞（Ba et al.，2017）。sTNF-α的传导主要通过结合TNFR1发挥作用，而tmTNF-α主要连接TNFR2发生效应，均能诱导多种信号通路的激活，包括核因子NF-κB和MAPK及细胞凋亡相关通路（Sade-Feldman et al.，2013）。TNF-α的生物学作用在种属间无明显差异，已有研究证实人类TNF-α与小鼠TNF-α的氨基酸序列相似性为79%，而功能和作用暂未发现差异性（Caminero et al.，2011）。还有研究表明，通过基因工程技术修饰TNF-α，在N端缺失2个氨基酸残基（1Val和2Arg）后，其生物学活性和抗肿瘤效应更佳（Solmaza et al.，2011）。此外，Solmaza等（2011）研究发现，将TNF-α的8Pro、9Ser、10Asp和157Leu分别替换为8Arg、  9Lys、10Arg和157Phe，合成TNF-α较天然TNF-α在体外杀伤L929细胞的活性约增强1000倍。在炎性感染过程中，TNF-α水平的升高能促进白三烯和氧自由基的生成，进一步损伤肠黏膜，加剧黏膜充血、水肿及坏死，导致机体皮肤发紫和肠道糜烂等症状（杨季云等，2007）。von Rosen等（2013）研究發现CSFV感染猪体后，其血清TNF-α水平均有所升高，且表现为弱毒株较强毒株的TNF-α水平延迟2～3 d到达峰值。Li等（2016）研究表明，在猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的感染过程中，整合素—金属蛋白酶17（A disintegrin and metalloproteinase-17，ADAM-17）参与TNF-α的产生。Bercier和Grenier（2019）研究发现，一些病原微生物入侵猪体时，可诱导其气管上皮细胞分泌TNF-α，进而破坏上皮屏障的完整性，使连接蛋白受损。【本研究切入点】TNF-α是一个关键的细胞调节因子，在针对细菌或病毒感染的免疫反应和炎症反应中发挥重要作用（Ting and Bertrand，2016）。至今，有关人类及鼠等生物的TNF-α已得到深入研究（Caminero et al.，2011），但针对猪TNF-α的研究相对较少。此外，研究病毒感染过程中猪体内TNF-α的变化规律及其作用机制需应用猪源TNF-α抗体，但目前生物制品市场尚缺乏此类抗体。【拟解决的关键问题】克隆猪TNF-α基因并进行原核表达及纯化，免疫昆明小鼠制备TNF-α多克隆抗体，采用Western blotting、ELISA及间接免疫荧光分析等方法验证猪源TNF-α多克隆抗体的特异性和反应性，并探索CSFV感染对PK-15细胞分泌TNF-α的影响，为揭示CSFV的致病机理打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

His标签鼠单克隆抗体、Flag标签鼠单克隆抗体、表达载体pGEX-4T-1和pcDNA3.0、PK-15细胞系、HEK-293T细胞系、脂质体2000转染试剂盒及CSFV石门株均由亚热带农业生物资源与利用国家重点实验室保存提供;4周龄SPF级昆明小鼠（平均体重18 g/只）购自广西医科大学实验动物中心;大肠杆菌TOP10和BL21（DE3）感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 引物设计与合成

在GenBank上搜索猪TNF-α基因序列（登录号JF831365.1）的完整编码区（CDS）序列，根据试验需求设计特异性引物（表1），并委托华大基因生物科技（深圳）有限公司合成。

1. 3 猪源TNF-α多克隆抗体制备

1. 3. 1 原核表达载体构建 提取CSFV病料基因组RNA，反转录合成cDNA作为PCR扩增模板，采用TNF-α-F/TNF-α-R引物对扩增TNF-α基因，并克隆至pMD18-T载体上获得重组质粒pMD18-T-TNF-α，然后与原核载体pGEX-4T-1分别进行双酶切，酶切产物经胶回收后以T4 DNA连接酶连接过夜，连接产物转化TOP10感受态细胞，经PCR鉴定阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，以鉴定原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α是否构建成功。

1. 3. 2 融合蛋白TNF-α表达及纯化 以原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α转化BL21感受态细胞，阳性菌落在37 ℃下摇床（200 r/min）培养至OD600达0.6～0.8，加入终浓度为0.05或0.50 mmol/L的IPTG，30 ℃诱导6 h。取诱导菌液进行超声波破碎，4 ℃下12000 r/min离心10 min，分别收集上清液、沉淀和总菌进行SDS-PAGE分析和Western blotting检测，以确定融合蛋白诱导表达的最佳条件及其表达形式;并对IPTG诱导浓度及诱导时间等条件进一步优化，确定大量表达融合蛋白的最佳条件。最后，对蛋白样品进行SDS-PAGE分析，经KCl染色后取相应位置的凝胶进行切胶，PBS反复冻融，最后稀释出的液体即为纯化融合蛋白。

1. 3. 3 免疫小鼠及收集血清 將纯化融合蛋白与弗氏佐剂乳化成混合物，采用背部皮下多点注射对SPF级昆明小鼠进行免疫，免疫周期按1、7、21和35 d进行4次免疫，每只小鼠每次注射的融合蛋白免疫剂量约500 μg，4次免疫后第7 d摘除小鼠眼球采血，收集血清，-80 ℃保存备用。

1. 4 猪源TNF-α真核表达载体构建及诱导表达

重组质粒pMD18-T-TNF-α经F-TNF1/F-TNF2引物对扩增TNF-α基因，然后克隆至真核载体pcDNA3.0上，通过PCR挑选阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，以鉴定真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α是否构建成功。HEK-293T细胞培养至70%～80%融合时，参考脂质体2000转染试剂盒说明，按脂质体∶质粒为2 μL∶0.8 μg的比例，以真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染HEK-293T细胞，转染24 h后收集细胞总蛋白，采用Flag标签鼠单克隆抗体（1∶1000）进行Western blotting检测。

1. 5 TNF-α多克隆抗体反应性及特异性鉴定

采用12孔板培养PK-15细胞至70%～80%融合时，弃上清液后感染1 MOI的CSFV，于感染后0、12、24、36、48和72 h分别收集细胞总蛋白，同时收集1.4中真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染的HEK-293T细胞样品，进行Western blotting检测。一抗为制备的TNF-α多克隆抗体，用PBS或牛奶封闭液稀释1000、2000、4000、8000和16000倍;二抗为HRP标记马抗小鼠IgG。此外，将PK-15细胞培养至70%～80%融合时，以真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α进行转染，转染12 h后进行间接免疫荧光分析，观察TNF-α在PK-15细胞内的表达情况。

1. 6 TNF-α多克隆抗体效价测定

以真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染的HEK-293T细胞样品为抗原，用抗原包被液进行稀释并包被ELISA酶标板底，然后以制备的TNF-α多克隆抗体为一抗、HRP标记马抗小鼠IgG为二抗，以未免疫的小鼠血清为阴性对照，利用间接ELISA测定TNF-α多克隆抗效价。

1. 7 TNF-α真核表达检测

以真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染PK-15细胞，分别在转染0、6、9、12、24、36和48 h后收集细胞样品，去除培养基，加入800 μL的RNA细胞裂解液，常温裂解5 min，吹打若干次后收集于1.5 mL EP管中，-80 ℃保存备用。用PBS洗涤细胞3次，每孔加入200 μL RIPA裂解液及2 μL蛋白酶抑制剂，冰浴10 min，转移至EP管中，分别进行实时荧光定量PCR鉴定及Western blotting检测。

2 结果与分析

2. 1 猪TNF-α基因片段测序分析结果

GenBank已收录的猪TNF-α基因序列（登录号JF831365.1）全长699 bp，共编码232个氨基酸残基;编码蛋白分子量为25 kD，其亲/疏水性预测结果如图1所示，抗原表位平均峰值均大于1.55，说明具有良好的抗原表位，可对基因全长进行原核表达。

2. 2 猪源TNF-α基因扩增结果

采用特异性引物TNF-α-F/TNF-α-R进行PCR扩增，获得699 bp的TNF-α基因目的条带（图2-A）。胶回收目的片段后与载体pMD18-T连接，并转化TOP10感受态细胞，菌液PCR鉴定结果如图2-B所示;对阳性菌进行质粒抽提，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果表明重组质粒pMD18-T-TNF-α构建成功。

2. 3 猪源TNF-α基因原核/真核表达载体构建情况

对构建获得的原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α和真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α分别进行双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示。送至生工生物工程（上海）股份有限公司的测序结果也均表明，原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α和真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α构建成功。

2. 4 融合蛋白TNF-α诱导及其表达形式鉴定结果

以原核表达载体pGEX-4T-1-TNF-α转化BL21感受态细胞，采用终浓度为0.05或0.50 mmol/L的IPTG进行诱导表达6 h，SDS-PAGE分析（图4-A）和Western blotting检测（图4-B）结果显示，重组菌体经IPTG诱导后能表达出约43 kD的融合蛋白，融合蛋白主要以包涵体形式进行表达，且以终浓度为0.05 mmol/L IPTG的诱导效果较优。

2. 5 融合蛋白TNF-α的纯化鉴定结果

由于融合蛋白TNF-α主要以包涵体形式进行表达，且载体设计时人工添加His标签序列，与Ni-NTA亲和层析柱结合较差，因此使用切胶纯化方法进行纯化。对融合蛋白TNF-α进行SDS-PAGE分析，以KCl染色后取目的蛋白条带进行切胶纯化，纯化的融合蛋白TNF-α再进行SDS-PAGE分析和Western blotting检测，结果显示在43 kD处有1条清晰的目的条带（图5），说明成功获得较高纯度的融合蛋白TNF-α。

2. 6 真核表达蛋白TNF-α鉴定结果

使用12孔板培养HEK-293T细胞至70%～80%融合时，分别转染表达载体pcDNA3.0及携带Flag标签的真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α，转染24 h后收集细胞总蛋白，以Western blotting检测HEK-293T细胞中融合蛋白TNF-α的表达情况，结果（图6）显示，除了在25 kD处观察到融合蛋白TNF-α外，在17 kD的位置还有少量的可溶性TNF-α。

2. 7 TNF-α多克隆抗体与真核表达蛋白的反应性

TNF-α多克隆抗体按1∶1000、1∶2000、1∶4000和1∶8000的比例进行稀释，通过Western blotting检测TNF-α多克隆抗体与真核表达蛋白的反应性，结果（图7）显示，1∶8000倍稀释TNF-α多克隆抗体时仍可检测到HEK-293T细胞转染表达的融合蛋白TNF-α，表明制备获得的TNF-α多克隆抗体具有良好的反应性。

2. 8 TNF-α多克隆抗體与CSFV感染PK-15细胞分泌蛋白TNF-α的反应性

采用12孔板培养PK-15细胞至70%～80%融合时，弃上清液后感染1 MOI的CSFV，于感染后0、12、24、36、48和72 h收集细胞总蛋白进行Western blotting检测，结果（图8）显示，CSFV感染后24 h其病毒蛋白开始表达，且呈上调趋势;而PK-15细胞分泌蛋白TNF-α从感染后36 h开始上调表达，于感染72 h时达峰值，其变化趋势与病毒蛋白基本一致，即CSFV能刺激PK-15细胞分泌蛋白TNF-α上调表达。

2. 9 TNF-α多克隆抗体特异性检测结果

以真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染PK-15细胞，真核载体pcDNA3.0转染为阴性对照，转染12 h后分别用Flag标签单克隆抗体（1∶500）和制备的TNF-α多克隆抗体（1∶300）为一抗孵育转染的PK-15细胞，以FITC荧光标记马抗鼠IgG抗体为二抗，荧光倒置显微镜下观察荧光信号并拍照分析。结果（图9）显示，真核载体pcDNA3.0转染的PK-15细胞未检测到荧光信号，而经真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染后其细胞荧光强度增强，可清楚观察到细胞形态，细胞核荧光较细胞质稍暗，说明融合蛋白TNF-α主要在细胞质中表达，且均匀分布，也表明TNF-α多克隆抗体与真核细胞表达TNF-α具有较好的反应特异性，可用于间接免疫荧光分析。

2. 10 TNF-α多克隆抗体效价测定结果

收集真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α转染的HEK-293T细胞样品为抗原，以制备的TNF-α多克隆抗体和未免疫小鼠血清为一抗，利用间接ELISA测定抗体效价。结果判定标准为TNF-α多克隆抗体孔的OD450 nm与未免疫小鼠阴性血清对照孔的OD450 nm比值差异显著（P/N）>2.1，鉴定为阳性的最高稀释度即为其抗体效价。由图10可知，当TNF-α多克隆抗体1∶8000稀释时，P为0.276，N为0.107，P/N=2.579>2.1;当TNF-α多克隆抗体1∶16000稀释时，P为0.230，N为0.119，P/N=1.932<2.1，因此确定TNF-α多克隆抗体效价为1∶8000。

2. 11 真核表达TNF-α及其下游因子（TRAF1）的变化

使用12孔板培养PK-15细胞至70%～80%融合时，分别转染真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α和真核载体pcDNA3.0，在转染0、6、9、12、24、36和48 h后收集PK-15细胞总蛋白和RNA样品，对TNF-α基因及TRAF1的表达变化进行分析。实时荧光定量PCR检测结果显示，PK-15细胞转染真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α后，TNF-α基因表达变化倍数在转染6 h时达74.8倍，转染12 h时达峰值（354.4倍），随后逐渐下降，至转染48 h时降至51.9倍;而真核载体pcDNA3.0转染组只有2.0～4.0倍的上升幅度（图11-A）。在TNF-α存在的条件下，PK-15细胞中的TRAF1表达受到影响，TRAF1表达变化倍数在转染12 h时可达3.4倍，变化趋势与TNF-α基因基本一致，但变化幅度不明显（图11-B）。Western blotting检测结果（图11-C）表明，TNF-α从转染12 h时开始表达，至转染24 h时表达量达峰值;随着TNF-α的表达，TRAF1的水平从转染12 h时开始上调，于转染24 h时达峰值后逐渐下调。可见，TNF-α与TRAF1的变化趋势基本一致，即二者间存在一定关联性。

3 讨论

CSFV感染能引起宿主皮肤、脾脏、肾脏及淋巴结等器官组织广泛性出血和淤血。CSFV进入血液循环系统后，最早侵害的是血管内皮细胞并诱导细胞分泌IL-1、IL-6和IL-8等促炎因子，由于入侵的数量相对较少，引起的炎症反应不强烈（范学政等，2013）。当CSFV在细胞内大量复制并释放到细胞外感染其他细胞时，则再次启动新一轮的促炎因子分泌，随着感染细胞数量的不断增加，炎症反应也愈加强烈，血管内皮细胞出现肿胀、变性、坏死，甚至脱落，而导致出血（Bensaude et al.，2004）。von Rosen等（2013）研究证实，CSFV感染猪只后其体内的TNF-α、INF-α和IL-8等促炎因子水平明显升高。本研究的Western blotting检测结果也表明，CSFV感染可引起PK-15细胞的TNF-α表达水平上调。此外，CSFV感染后能刺激核转录因子NF-κB产生，从而引起肠道炎症反应，致使结肠黏膜损伤（Hiscott et al.，2001）。NF-κB是一类与某些基因启动子区特定核苷酸序列结合的蛋白，进而调控基因的转录过程（Dong et al.，2013）。NF-κB广泛表达于多种组织细胞中，在多条信号通路中发挥转录调节作用，且激活后可与不同基因一起调控转录过程，尤其在肿瘤的形成和发展中扮演着重要角色（刘金辉等，2008）。TRAF1是肿瘤坏死因子受体相关因子家族的重要成员之一，也是TNF-α下游的重要因子，在TNF-α诱导NF-κB的过程中发挥重要作用。TNF-α和TRAF1均属于NF-κB通路相关蛋白，但其具体作用机制尚未明确。

由于猪TNF-α基因编码蛋白亲水性较好，抗原表位平均峰值均大于1.55，全长都具有良好的抗原表位，无信号肽，因此本研究以猪TNF-α基因全长进行原核表达。融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达，会导致包涵体形成，但包涵体在纯化时需使用变性剂将其溶解，充分暴露出His标签，以便与Ni-NTA层析柱结合而达到纯化蛋白的目的（李延生等，2014;陈东荣等，2021）。虽然Ni-NTA层析法具有操作简单的优点，但其电泳、透析及染色等过程耗时较长，致使蛋白纯化效率降低，纯化成本增高。本研究选用KCl染色切胶纯化蛋白的方法，在保证不改变原有蛋白生物活性的前提下，参考NaAc染色切胶纯化法，以KCl取代NaAc染色蛋白及反复冻融后，并通过快速离心等步骤取代原来的电泳后过夜透析等步骤，结果显示，KCl染色切胶纯化获得的融合蛋白TNF-α经SDS-PAGE分析和Western blotting检测，证实其纯度和浓度均满足免疫要求，将融合蛋白TNF-α与弗氏佐剂乳化后对SPF级昆明小鼠进行4次免疫，制备获得的TNF-α多克隆抗体具有良好的反应性，其效价为1∶8000。

为了验证TNF-α多克隆抗体的反应性，本研究利用真核载体pcDNA3.0成功构建真核表达载体pcDNA3.0-TNF-α，分别转染HEK-293T细胞和PK-15细胞后均可表达出接近于天然结构的融合蛋白，且具有完整的空间结构，与真核细胞表达蛋白呈高度亲和性。间接免疫荧光分析结果也证实TNF-α多克隆抗体可检测在PK-15细胞中过表达的TNF-α，且有较强的特异性荧光;通过Western blotting还能检测到CSFV感染PK-15细胞后产生的内源性TNF-α。可见，本研究制备获得的TNF-α多克隆抗体具有良好的反应性和特异性。此外，PK-15细胞感染CSFV后，TNF-α的表达呈明显上调趋势;在PK-15细胞中过表达TNF-α时，其下游因子TRAF1的mRNA和蛋白水平均呈上调趋势，即TNF-α能上调TRAF1的表达。TNF-α和TRAF1均能刺激NF-κB产生，而NF-κB普遍存在于多种组织细胞中，具有多向转录调节作用，并发挥多种生物学功能（Devergne et al.，1996）。CSFV感染PK-15细胞后，TNF-α和TRAF1的表达变化趋势基本一致，说明CSFV入侵动物机体后同时刺激TNF-α和TRAF信号通路，使机体产生炎症反应。

4 结论

制备获得的TNF-α蛋白抗体具有效价高、反应性好及特异性强的特点，可用于检测CSFV感染后真核细胞中过表达的TNF-α水平。TNF-α可刺激TRAF1產生，参与TRAF1相关信号通路而发挥其生物学功能，CSFV感染PK-15细胞后TNF-α和TRAF1的表达变化趋势基本一致，说明CSFV能同时刺激TNF-α和TRAF1信号通路，使机体产生炎症反应。

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（責任编辑 兰宗宝）