抗菌药对紫花苜蓿萌发的生态毒性作用

郑汝青，杨剑，周玲，孙海峰，廖书丹，王剑，谭艾娟，吕世明

摘要：【目的】探明土霉素、磺胺嘧啶和氧氟沙星殘留对紫花苜蓿种子萌发和幼苗生长的影响，了解3种药物对牧草的生态毒理效应，以期为评价畜禽排泄物中抗菌药污染对生态安全的影响提供科学依据。【方法】试验采用水培法，3种药物均设7个浓度梯度，分别为0（CK）、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0和50.0 ?g/mL，分析不同浓度药物对紫花苜蓿种子萌发特性、幼苗生长及叶绿素含量的影响。【结果】≥50.0 ?g/mL的土霉素能显著抑制紫花苜蓿种子萌发（P<0.05），其余2种药物对紫花苜蓿种子的萌发均无显著影响（P>0.05）。除≤0.5 ?g/mL磺胺嘧啶对紫花苜蓿株高有促进作用外，其他药物对紫花苜蓿幼苗根长和株高均起抑制作用，且抑制作用整体上表现为根长>株高，高浓度（5.0～50.0 ?g/mL）抑制作用相对较强;不同浓度土霉素处理均能增加紫花苜蓿幼苗干重，而磺胺嘧啶和氧氟沙星在较低浓度时（≤1.0 ?g/mL）可不同程度地增加紫花苜蓿幼苗干重，高浓度（>5.0 ?g/mL）时则减少紫花苜蓿幼苗干重;随浓度的增加，磺胺嘧啶和土霉素可降低紫花苜蓿幼苗含水量，而氧氟沙星处理下紫花苜蓿幼苗含水量先减后增。3种药物对紫花苜蓿幼苗叶片叶绿素含量的影响表现为氧氟沙星>磺胺嘧啶>土霉素，且土霉素和氧氟沙星处理的叶绿素含量均随药物物浓度的增加而降低。【结论】磺胺嘧啶和氧氟沙星各浓度下对紫花苜蓿种子萌发基本无影响，高浓度土霉素可抑制种子萌发;3种抗菌药对根长、株高、干重、含水量及叶绿素均有不同程度影响，主要损伤体现在对根长、株高的伸长和叶绿素合成的抑制。

关键词： 抗菌药;紫花苜蓿;生态毒理;土霉素;磺胺嘧啶;氧氟沙星

中图分类号： S541.9                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）09-2457-08

Ecological toxicity of antibiotics on the germination

of Medicago sativa

ZHENG Ru-qing1， YANG Jian1， ZHOU Ling1， SUN Hai-feng2， LIAO Shu-dan1，

WANG Jian1， TAN Ai-juan2*， LYU Shi-ming1*

（1College of Animal Science， Guizhou University， Guiyang  550025， China; 2College of Bioscience，

Guizhou University，Huaxi， Guiyang  550025， China）

Abstract：【Objective】This study explored the effects of oxytetracycline，sulfadiazine and ofloxacin residues in livestock manure on the germination and seeding growth of Medicago sativa to understand the ecotoxicological effects of these three drugs on forage crops and to provide a scientific basis for the evaluation of the effects of antimicrobials in livestock and poultry excreta on ecological security. 【Method】Ahydroponic method was used with seven concentrations of each antibiotic [0（CK）， 0.1， 0.5， 1.0， 5.0， 10.0 and 50.0 ?g/mL] to analyze their effects on germination characteristics， seedling growth and chlorophyll content in M. sativa. 【Results】Oxytetracycline at ≥50.0 ?g/mL significantly inhibited the seed germination of M. sativa （P<0.05），while the other two drugs had no significant effect （P>0.05）. Sulfadiazine promoted greater plant height at ≤0.5 ?g/mL，while the other drugs had a significant inhibitory effect on the root length and， to a lesser extent， plant height of seedlings at higher concentrations （5.0-50.0 ?g/mL）. Different concentrations of oxytetracycline increased the dry weight of M. sativa seedlings， while increases were observed with sulfadiazine and ofloxacin only at lower concentrations （≤1.0 ?g/mL）; higher concentrations（>5.0 ?g/mL） caused decreases. Sulfadiazine and oxytetracycline caused larger decreases in seedling water content with increasing concentration， while ofloxacin caused the water content to decrease at lower concentrations but water content increased at higher concentrations. The three antibio-tics caused decreases in chlorophyll content in the order of ofloxacin>sulfadiazine>oxytetracycline. The chlorophyll content of oxytetracycline and ofloxacin decreased with  increasing concentration. 【Conclusion】Sulfadiazine and ofloxacin have little effect on M. sativa germination at all concentrations tested， whereas high concentrations of oxytetracycline inhibited germination.The three antibacterial drugs have different effects on root length， plant height， dry weight， water content and chlorophyll， with the main deleterious effects being the inhibition of root length， plant height and chlorophyll synthesis.

Key words： antibiotic; Medicago sativa; ecotoxicology; oxytetracycline; sulfadiazine; ofloxacin

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31760749）; Science and Technology Project of Guizhou（Qiankehezhicheng〔2018〕2276）

0 引言

【研究意義】抗菌药除在医药行业作为药物治疗人类和动物疾病外，还可添加到肥料或畜禽饲料中以提高农作物或动物的质量和产量（李兆君等，2008）。在我国大量生产和使用的抗菌药中，四环素类、喹诺酮类和磺胺类抗菌药的使用量较大，但抗菌药在生物体内的利用率不高，通常会以原型残留在动物粪便或以生物固体的形式释放到环境中（Díaz-Cruz et al.，2006;Kemper，2008），在大气、水和土壤中均检测出多种抗菌药的残留，给生态环境带来了较多负面影响。此外，抗菌药会通过植物的富集作用残留在生物体内，通过生物放大效应，对人类健康和生态系统造成潜在危害（李霞等，2010）。苜蓿（Medicago sativa）是当今世界分布最广，也是我国种植面积最大的栽培牧草，以“牧草之王”著称，对促进畜禽的生长发育和提高畜产品品质有重要作用，是家畜最理想的饲草饲料之一。紫花苜蓿作为饲料生产的重要原材料，其生长与品质直接影响畜禽生产质量。因此，探讨抗菌药对紫花苜蓿萌发的生态毒性作用，可为牧草业在牧草栽培环境的选择方面提供参考，并对畜牧业饲料生产及畜禽产品安全评价提供科学依据。【前人研究进展】目前，黑麦草（赵月，2016）、番茄（徐秋桐，2019）、生菜（王卫中，2020）等多种植物中均检测到抗菌药的残留。关于抗菌药对植物的影响，前人研究结果存在差异。Pan等（2016）研究四环素、磺胺二甲嘧啶、诺氟沙星、红霉素和氯霉素对生菜、番茄、胡萝卜和黄瓜种子萌发和根伸长的影响，结果显示4种抗菌药对植物的根伸长均有显著抑制作用。张昊（2018）研究表明，抗菌药暴露条件下小白菜可吸收水培环境中的抗菌药，且含抗菌药条件下可影响小白菜生长并增加抗菌药耐药内生细菌的数量。王亚萌（2019）研究发现，氟喹诺酮类药物可显著减少黑麦草叶绿素含量，浓度越高对叶绿素含量抑制作用越强。郑曦和张凯（2019）研究发现，盐酸左氧氟沙星氯化钠、青霉素钠、阿奇霉素和头孢唑林刚对不同种类玉米的发芽率、根长、茎长、幼苗干重、叶绿素及过氧化物酶活性均有不同程度的影响;张天莹等（2020）用抗生素胁迫小麦种子的萌发和幼苗生长发育，结果表明磺胺二甲基嘧啶和环丙沙星可抑制小麦的正常生长。【本研究切入点】近几年，抗菌药对植物的生态毒性研究逐渐增加，但多集中在与人类食品安全相关的蔬菜上，而与畜牧养殖业养殖安全相关的牧草生态毒理研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以紫花苜蓿种子为试验对象，探究畜禽排泄物中3种常见抗菌药（土霉素、磺胺嘧啶和氧氟沙星）对紫花苜蓿种子萌发、幼苗生长和叶绿素含量的影响，了解3种药物对牧草的生态毒理效应，以期为评价畜禽排泄物中抗菌药污染对生态安全的影响提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验用紫花苜蓿种子为美国百绿公司三得利品种，购于贵州众智恒生态科技有限公司。

试验试剂：磺胺嘧啶标准品（纯度≥99%）、氧氟沙星标准品（纯度≥99%）购于大连美仑生物技术有限公司，土霉素标准品（纯度≥99%）购于上海盛思生化科技有限公司，Hoagland营养液购于北京酷来搏科技有限公司。

1. 2 试验方法

试验设7个药物浓度梯度，分别为0（CK）、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0和50.0 ?g/mL。种子消毒方法：5%次氯酸钠浸泡20 min，蒸馏水清洗5～6次，75%乙醇浸泡3 min，蒸馏水清洗3次以上。消毒后挑选饱满均一的种子，取50粒放置于内铺2层无菌滤纸的9 cm培养皿中，每处理4个重复。每个培养皿中加入5 mL药液，置于恒温光照培养箱中培养7 d后结束萌发，光照/黑暗为16 h/8 h，恒温20 ℃，光照强度为6000 lx。因植物对抗菌药的吸收不完全，期间水分蒸发无法控制药物浓度，每天定时向培养皿中补充1 mL散失水分，且每隔2 d添加2 mL对应浓度药液。发芽全过程在光照培养箱中进行。

1. 3 测定指标及方法

1. 3. 1 萌发指标测定 萌发期间每天观察发芽情况并测定发芽率（以胚根露出2 mm作为发芽标准），在发芽高峰期（第3 d）统计发芽势，直至发芽数趋于稳定。参照GB/T 2930.4—2017《草种子检验规程 发芽试验》计算发芽指标：发芽率（%）=发芽种子数/供试种子数×100;发芽势（%）=3 d内种子发芽数/供试种子数×100;发芽指数（GI）=∑Gt/Dt，式中，Gt为t日的发芽数，Dt为发芽天数。

1. 3. 2 生长指标测定 7 d结束萌发后，每个培养皿中挑取10株长势一致的幼苗，用游标卡尺测量苗高和根长，测定10株幼苗的总鲜重，将幼苗放入纸袋于60 ℃烘箱烘干至恒重，称量并记录干重，计算根长和株高的抑制率。抑制率（%）=（对照组测量值-处理组测量值）/对照组测量值×100。

1. 3. 3 叶绿素含量测定 叶绿素含量采用丙酮提取—微量法测定。将萌发7 d后的新鲜紫花苜蓿幼苗叶片洗净擦干，除去叶中脉，称取约0.1 g，剪碎加入丙酮∶无水乙醇（2∶1）混合液和少量碳酸钙研磨，棕色容量瓶定容至10 mL，置于黑暗条件下浸提至底部组织残渣颜色接近于白色则提取完全，用酶标仪测定645和663 nm处的吸光值。

1. 4 统计分析

采用SPSS 22.0进行试验数据的单因素（One-way ANOVA）方差分析和Duncan多重比较，采用Ori-gin 2018制图。

2 结果与分析

2. 1 抗菌药对紫花苜蓿种子萌发的影响

2. 1. 1 磺胺嘧啶对紫花苜蓿种子萌发的影响 由表1可知，与CK相比，不同浓度磺胺嘧啶对紫花苜蓿的发芽率、发芽势和发芽指数均无显著影响（P>0.05，下同）。0.1 ?g/mL浓度下种子发芽势受到一定抑制，抑制率为6.45%;0.5～50.0 ?g/mL浓度处理对种子发芽势起促进作用。

2. 1. 2 土霉素对紫花苜蓿种子萌发的影响 由表2可知，土霉素浓度在0.5～5.0 ?g/mL时对紫花苜蓿种子萌发起一定的促进作用，但作用效果均不显著;当土霉素浓度升高到10.0～50.0 ?g/mL时，则显著抑制紫花苜蓿的发芽率（P<0.05，下同），同时50.0 ?g/mL浓度处理对发芽势也有显著抑制作用，说明在该浓度下土霉素可影响种子发芽的整齐度;随药物浓度的增加，紫花苜蓿的发芽指数呈先上升后下降的变化趋势，0.5～1.0 ?g/mL浓度下紫花苜蓿的发芽指数最高，与50.0 ?g/mL时呈显著差异。

2. 1. 3 氧氟沙星对紫花苜蓿种子萌发的影响 由表3可知，不同浓度氧氟沙星处理下，紫花苜蓿种子的发芽率均低于CK，但与CK的差异未达显著水平，且各浓度处理对种子发芽势和发芽指数的作用效果也均不显著。

2. 2 抗菌药对紫花苜蓿幼苗生长的影响

2. 2. 1 磺胺嘧啶对紫花苜蓿幼苗生长的影响 从图1可直观看出磺胺嘧啶对根长的抑制作用大于对株高的抑制作用。从图2和图3可知，不同浓度磺胺嘧啶处理的紫花苜蓿根长均低于CK，0.1～1.0 ?g/mL浓度处理对紫花苜蓿根长的抑制作用较小，平均抑制率为8.90%，随着磺胺嘧啶浓度升高（≥5.0 ?g/mL），根长抑制率急速增加，50.0 ?g/mL处理的根长抑制率达71.90%;磺胺嘧啶对紫花苜蓿株高的影响体现在低浓度（0.1～0.5 ?g/mL）促进，高浓度（10.0～50.0 ?g/mL）抑制，其中最高抑制率达34.71%;不同浓度磺胺嘧啶处理下紫花苜蓿干重呈先增加后减少的变化趋势，0.1～5.0 ?g/mL处理能一定程度上增加干重，而浓度大于10.0 ?g/mL后干重减少，50.0 ?g/mL处理的干重显著低于CK;与CK相比，0.1～1.0 ?g/mL处理的紫花苜蓿含水量无显著变化，而磺胺嘧啶浓度高于5.0 ?g/mL后，紫花苜蓿含水量显著降低。

2. 2. 2 土霉素对紫花苜蓿幼苗生长的影响 与CK相比，添加土霉素后紫花苜蓿幼苗的根长均受到不同程度的抑制（图4）。从图5可看出，土霉素浓度为0.1～0.5 ?g/mL时对根长影响不显著，1.0～50.0 ?g/mL浓度处理的根长较CK显著变短，根长最高抑制率达42.45%（图6），根长总体上呈随药物浓度增加而减少的变化趋势;在不同浓度土霉素作用下，紫花苜蓿幼苗的株高均受到显著抑制，抑制率在8.55%～18.72%（图6）;添加土霉素对紫花苜蓿幼苗干重有促进作用，0.1～0.5 ?g/mL浓度处理可显著促进干重增加，之后随浓度增加促进作用降低;土霉素浓度高于5.0 ?g/mL时可显著降低紫花苜蓿含水量。

2. 2. 3 氧氟沙星对紫花苜蓿幼苗生长的影响 由图7可看出，随氧氟沙星浓度升高，紫花苜蓿幼苗根长受抑制程度增大。由图8和图9可知，氧氟沙星对紫花苜蓿幼苗根伸长的抑制作用随浓度增加而加强，0.5～50.0 ?g/mL处理的根长受到显著抑制，最高抑制率可达74.34%;不同浓度氧氟沙星对紫花苜蓿幼苗株高均有显著抑制，50.0 ?g/m浓度处理的抑制率最高，达54.68%;添加≤1.0 ?g/mL的氧氟沙星可增加紫花苜蓿幼苗的干重，而氧氟沙星浓度≥5.0 ?g/mL时可显著降低紫花苜蓿幼苗干重;紫花苜蓿幼苗含水量随着氧氟沙星浓度的增加呈先降低后升高的变化趋势，1.0 ?g/mL浓度处理的含水量降至最低。

2. 3 抗菌药对紫花苜蓿幼苗叶绿素含量的影响

从图10可看出，磺胺嘧啶处理可不同程度降低紫花苜蓿幼苗叶片的叶绿素含量，当磺胺嘧啶浓度<0.5 ?g/mL时，随浓度增高叶绿素含量逐渐减少，当浓度增加到1.0 ?g/mL时叶绿素含量与CK相当，之后随浓度增加叶绿素含量逐渐降低;整体来说，磺胺嘧啶对紫花苜蓿幼苗叶片的叶绿素起抑制作用;低浓度（0.1～1.0 ?g/mL）土霉素处理对紫花苜蓿幼苗叶片的叶绿素含量基本无影响，而高浓度（5.0～50.0 ?g/mL）土霉素处理可显著降低叶绿素含量，较CK减少21.43%～42.86%;氧氟沙星对紫花苜蓿幼苗叶片叶绿素含量的抑制作用最明显，随氧氟沙星浓度升高，叶绿素含量持续下降。整体来看，3种药物对紫花苜蓿幼苗叶片叶绿素含量的影响表现为氧氟沙星>土霉素>磺胺嘧啶。

3 讨论

种子萌发是植物生命周期的初始阶段，更是植物天然更新的关键，萌发的种子对各种内外刺激非常敏感（Yin and Bernhardt，2012;程贝等，2019）。不同的抗菌药对不同植物种子萌发的影响也存在差异，如≥10 mg/L的链霉素、四环素和氯霉素对桑树种子发芽率有一定程度的促进作用（陈智鑫等，2018），而不同浓度头孢菌素C对生菜、油麦菜、白菜及油菜种子的发芽率均无显著差异（周睫雅等，2020），低浓度金霉素、左氧氟沙星、磺胺甲恶唑等10种抗菌药对莴苣、苜蓿和胡萝卜的发芽率均无顯著影响（Hillis et al.，2011）。肖明月等（2014）研究显示，在土霉素浓度≤10 mg/L时，对小白菜种子发芽率无显著影响，随着浓度的增加开始出现抑制作用且浓度越高效果越显著。邓世杰等（2019）研究表明，磺胺嘧啶浓度>0.5 mg/L时对黑麦草发芽率有显著抑制作用。本研究中，除土霉素10.0和50.0 ?g/mL浓度处理显著抑制紫花苜蓿发芽率外，其他土霉素处理及磺胺嘧啶和氧氟沙星处理对紫花苜蓿种子的萌发基本无显著影响，与Hillis等（2011）、肖明月等（2014）的研究结果一致，而与邓世杰等（2019）的研究结果存在差异。本研究中不同浓度磺胺嘧啶对紫花苜蓿的发芽率均无显著影响，仅50.0 ?g/mL处理对发芽指数有显著抑制。有研究表明，种皮可一定程度上阻碍抗菌药胁迫对种子带来的损害，而种皮对不同抗菌药有不同的阻碍作用（张乙涵等，2014）;但种皮的阻碍作用有限，并不能完全阻碍抗菌药对种子的毒理效应（肖明月等，2014）。试验结果存在差异的原因尚需深入研究。

植物对外界物质的敏感性主要体现在根和茎的伸长上。与茎长相比，根长受外界环境的影响更明显。由于植物幼苗根部直接与药液接触，对其中污染物的响应较迅速，因此，根长对外界污染物较敏感（宋玉芳等，2002）。本研究发现，3种药物对紫花苜蓿幼苗的抑制作用表现为根长>株高>干重>含水量。抗菌药对植物根和茎的伸长有双向作用，即在低浓度时有一定的促进作用，高浓度则出现抑制作用，之后随药物浓度增加抑制作用加强（鲍艳宇等，2008）。王盼亮等（2017）研究发现，≤50 ?g/mL的四环素和环丙沙星对小白菜根长和株高的抑制率分别可达33.54%～65.54%和23.46%～70.11%。邓世杰等（2019）、Han等（2019）研究发现，用不同抗菌药胁迫黑麦草后，黑麦草根长和茎长受到的抑制作用随浓度的增加而增加。本研究中，磺胺嘧啶、土霉素和氧氟沙星对紫花苜蓿幼苗根长的最高抑制率可达71.90%、42.45%和74.34%，对株高的最高抑制率可达34.71%、18.72%和54.68%，可看出3种药物对紫花苜蓿的抑制作用表现氧氟沙星>磺胺嘧啶>土霉素，且对根长的抑制作用较强。推测其原因可能是由于磺胺嘧啶在环境中的稳定性较土霉素高，降解较缓慢（Hektoen et al.，1995），从而对紫花苜蓿的伤害较持久;与根长和株高抑制率相对应，磺胺嘧啶和氧氟沙星对根长的抑制作用较大，相应减少了紫花苜蓿幼苗干物质的量;土霉素对株高抑制作用较小，对干重的影响也较小。

叶绿素作为植物光合作用的重要色素，能间接反映植物光合作用的强弱;逆境胁迫能影响植物的各种生理活动，并直接或间接影响叶绿素含量（李慧芳等，2014）。Rydzyński等（2017）研究表明，四环素可降低黄色羽扇豆幼苗中的叶绿素含量。本研究中，紫花苜蓿幼苗叶片中的叶绿素含量也随3种抗菌药浓度的增加而减少，与Rydzyński等（2017）的研究结果相似。其原因可能是植物在含有药物的环境中会导致叶片中的类胡萝卜素含量减少，抑制光合系统Ⅱ（Zhu et al.，2011）和叶绿素的生物合成（Kong et al.，2007）。

综上所述，环境抗菌药的存在可一定程度上抑制紫花苜蓿幼苗的生长，推测抗菌药的抗菌作用可能抑制环境中部分不利于植物生长的微生物，故极低浓度下（<0.1 ?g/mL）可能会对紫花苜蓿幼苗根茎伸长起到促进作用，但浓度>0.5 ?g/mL后则开始对紫花苜蓿幼苗产生生态毒性;而氧氟沙星存在的环境中，低浓度下也可对紫花苜蓿幼苗产生严重的毒性作用。该结果可为畜牧养殖业养殖过程中动物粪便、尿液兽用抗菌药残留对牧草的毒性问题及抗菌药污染下的生态影响、饲草栽培和环境生态安全等研究提供参考。

4 结论

磺胺嘧啶和氧氟沙星各浓度下对紫花苜蓿种子萌发基本无影响，高浓度土霉素可抑制种子萌发;3种抗菌药对根长、株高、干重、含水量及叶绿素均有不同程度影响，主要损伤体现在对根长、株高的伸长和叶绿素合成的抑制。

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（責任编辑 王 晖）