柠檬香茅资源的抗寒性评价与筛选

李海明 吴水金 黄惠明 李跃森 郑开斌

摘要：以4个柠檬香茅资源（漳州香茅、广东香茅、永春香茅、新西兰香茅）的叶片作为材料，进行-25、-15、0、5、15 ℃低温处理，测定相对电导率、MDA含量、SOD活性及POD活性，计算半致死温度（LT50），并应用隶属函数法对各生理指标进行综合评判。结果表明，随着处理温度的降低，4个柠檬香茅资源的相对电导率呈逐渐升高的趋势，半致死温度为-21.81～-20.94 ℃。低温胁迫过程中，各香茅品种的SOD、POD活性整体呈升高的趋势;MDA含量随着处理温度的降低逐渐升高。采用隶属函数综合评价的4个香茅资源的抗寒性，其由强到弱依次为漳州香茅>永春香茅>新西兰香茅>广东香茅。通过抗寒性评价可知，漳州香茅、永春香茅可向低温地区引种或作为抗寒育种材料。

关键词：柠檬香茅;抗寒性;生理生化指标;隶属函数法

中图分类号： S573+.401  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）14-0123-04

香茅是禾本科香茅属约55 种芳香性植物的统称，亦称为香茅草，为常见的香草之一[1]，其中柠檬香茅（Cymbopogon citratus）又称柠檬草，叶有很浓的柠檬味，原产于东南亚热带地区，我国广东、广西、云南、福建、海南和台湾等省均有栽培，喜高温多湿气候，在无霜或少霜害地区生长良好，由于根系发达，能耐旱、耐瘠，生长比较粗放，不论砂土、黏土还是其他瘠瘦的土壤均可生长[2-3]。温度条件是植物正常生长的重要环境因素，因此低温会限制植物分布，是引种环节需要考虑的环境因素之一[4]。目前香茅属植物的研究集中在提取工艺、精油成分、抑菌作用及成分分析上[5-8]，抗寒性方面的研究相对较少。在低温胁迫下，植物体内发生复杂的生理生化反应，各项生理生化指标的变化能够科学、准确地鉴定出植物抗寒性，是植物体内一系列生理生化过程综合作用的结果，受外界环境因子的影响或制约[9];相对电导率、丙二醛 （malondialdehyde，MDA）含量随着温度的降低而上升[10-11]，温度越低，增幅越大;植物体内抗氧化酶活性减弱[12]，这些生理生化指标的变化，对植物引种和栽培具有一定的指导意义。本研究对4个柠檬香茅资源进行不同低温处理，测定其各项生理生化指标，以期为柠檬香茅资源的引种，尤其是向低温地区引种，提供理论参考依据。植物在低温胁迫下，体内会发生复杂的生理生化反应，低温下细胞膜的通透性增加，MDA含量随着温度降低而上升，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性随着温度降低而增强，已作为评价植物抗寒性的生理生化指标，对植物引种和栽培具有指导意义。香茅资源的耐寒性及抗寒性方面的研究未见报道，因此本研究对4个柠檬香茅资源（漳州香茅、广东香茅、永春香茅、新西兰香茅）进行-25、-15、0、5、15 ℃低温处理，测定相对电导率、MDA含量、SOD活性及POD活性，计算半致死温度（LT50），并应用隶属函数法对各生理指标进行综合评判，筛选出抗寒性强的柠檬香茅资源，以期为柠檬香茅资源向低温地区引种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

柠檬香茅资源种植于福建省漳州市龙文区朝阳镇的福建省农业科学院热带农业研究所试验地（117°43′41″E、24°32′57″N）。于2020年7月选择田间长势良好的柠檬香茅品种资源柠檬香茅、永春香茅、广东柠檬香茅、新西兰香茅，分别剪取茎上部叶片，迅速带回实验室，叶片用自来水冲洗干净，再用超纯水冲洗3次后滤纸吸干，用湿润的纱布包裹，分别在-25、-15、0、5、15 ℃的温度下处理24 h，处理后的样品用于各项生理指标测定。

1.2 方法

1.2.1 电导率的测定 参考邹琦的方法[13]测定相对电导率。将低温处理后的叶片剪成0.5 cm大小，称取叶片0.1 g，每个处理3个重复，放入干净的具刻度的玻璃试管中，加入去离子水，浸没样品，静置12 h 后，用 DDS-11A型电导率仪测定叶片浸提液电导率，记为R1。然后将玻璃试管管盖旋紧，放入水浴锅 99 ℃水浴 30 min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导率，记为R2，计算叶片相对电导率（REC）=（R1/R2）×100%。

1.2.2 半致死温度（LT50）的计算 利用相对电导率，拟合Logistic方程，能够确定植物的半致死温度 （LT50），用 SPSS 19.0统计软件对不同处理温度与叶片相对电导率之间的关系进行非线性回归分析，用 Logistic方程y=k/（1+ae-bx）来拟合，式中：y为相对电导率;x为处理温度;k为细胞伤害率饱和容量，即y的最大极限值;a、b为方程参数。为了确定 a、b的值，将方程线性化处理得到ln[（k-y）/y]=lna-bx，令 y1=ln[（k-y ）/y]，转化为细胞伤害率与处理温度的直线方程。通过回归求得 a、b值及决定系数r2，用曲线的拐点作为香茅半致死温度，即LT50=-（lna）/b，确定不同香茅品种的抗寒性。

1.2.3 酶液的制备 称取低温胁迫处理后的香茅叶片约1.0 g，分别取各处理材料按照质量体积比（g/mL）1 ∶ 9的比例加入9.0 mL的0.1 mol/L磷酸缓冲液（PBS）（pH值=7.0），研磨，4 ℃ 条件下 8 000 r/min 离心10 min，取上清液即为待测酶液。

1.2.4 生理生化指标的测定 参照邹琦的方法[13]测定生理指标。SOD活性采用NBT光反应还原法测定，POD活性采用愈創木酚法测定，MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法测定。

1.3 数据处理

用DPS 3.0与Excel 2013进行数据分析和显著性分析。参照文献[14-15]的方法计算抗寒性隶属函数值，应用隶属函数法对各生理指标进行综合评判。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下叶片相对电导率及半致死温度测定

由图1可知，4个香茅品种资源在15 ℃时，相对电导率相当，在62%左右，随着胁迫温度的降低，4个品种的相对电导率呈增加的趋势，可见柠檬香茅叶片相对电导率与低温胁迫温度呈负相关，叶片细胞膜受损严重，电导率不断升高。5 ℃时，永春香茅的相对电导率最低，为65.59%，其次是新西兰香茅，为71.29%;当温度到0 ℃时，漳州本地香茅的相对电导率最低，为84.40%，其余3个品种相当;当温度胁迫到-25 ℃，4个品种的相对电导率相当。

从Logistic方程和拟合的结果（表1）来看，低温胁迫下相对电导率与温度之间的关系曲线能较好地用 Logistic曲线方程y=k/（1+ae-bx）进行拟合，r2值在0.840～0.982之间，表明不同低温处理的相对电导率的变化符合 Logistic方程的变化规律，与半致死温度呈较强的线性关系，拟合结果较为精确，4个柠檬香茅资源的LT50从小到大依次是漳州香茅、永春香茅、新西兰香茅、广东香茅，半致死温度依次为-21.81、-21.49、-21.13、-20.94 ℃。半致死温度高，说明品种的抗寒性相对较差，易受低温胁迫的危害。可见，漳州本地香蒿的抗寒性最好。

2.2 低温胁迫下不同香茅品种SOD活性的变化

从表2可以看出，随着温度的降低，广东香茅和永春香茅的SOD活性较为稳定，广东香茅在 -25 ℃ 时的酶活性为145.27 U/g，比15 ℃的酶活性134.35 U/g增加8.13%，永春香茅在 -25 ℃ 时的酶活性比15 ℃的酶活性增加21.20%;15～0 ℃，漳州香茅的SOD活性增加不显著，当温度降至-25 ℃时，SOD的活性与前4个温度相比，极显著增加;另外，新西兰香茅随着温度的降低，SOD活性整体逐渐增加，当温度降至 -25 ℃ 时，SOD的活性与前4个温度相比极显著增加。SOD的活性升高，表明植物在受到低温胁迫时，是植物的酶保护系统对低温的一种应激反应，起到保护植株的作用，可见漳州香茅、新西兰香茅的抗寒性比广东香茅、永春香茅好，各香茅品种资源的抗寒性表现为漳州香茅>新西兰香茅>永春香茅>广东香茅（表2）。

2.3 低温胁迫下不同香茅品种POD活性的变化

从表3可以看出，4个香茅品种随着胁迫温度的降低，POD活性呈现升高的趋势，其中广东香茅的POD活性在15 ℃时为440.00 U/（g·min），温度在 5 ℃ 时，其POD活性略有降低，但与15 ℃时的POD活性差异不显著，随着胁迫温度的降低，POD活性不断升高，在-25 ℃时POD活性为 1 086.67 U/（g·min），增加了146.97%;漳州香茅的POD活性与广东香茅相似，5 ℃时略有下降，随着胁迫温度的降低，POD活性不断升高，在-25 ℃时POD活性为 2 376.67 U/（g·min），增加了184.06%;新西兰香茅的POD活性随着温度的降低不断增加，在 -25 ℃ 时POD活性为1 476.67 U/（g·min），增加了486.75%;永春香茅的POD活性随着温度的降低不断增加，在-25 ℃时POD活性为 856.67 U/（g·min），增加了252.06%;从POD活性累积来看，新西兰香茅、永春香茅的POD活性明显比其余2个品种的活性要高，POD活性的增加，表明抗寒能力增强，可见，新西兰香茅、永春香茅的抗寒性高于其他2个品种。

2.4 低温胁迫下不同香茅品种MDA含量的变化

由表4可知，4个香茅品种的丙二醛含量由15 ℃ 至-25 ℃均表现出上升的态势。说明温度越低，植物自身的受害程度越嚴重。但品种间对比可以发现，在胁迫的5个温度下，广东香茅的MDA含量明显高于其他3个香茅品种，说明广东香茅的抗寒能力低于其他3个香茅品种;漳州香茅在胁迫的5个温度下，各胁迫温度的MDA含量明显低于其他3个品种，说明漳州香茅的受伤害程度小，而广东香茅的受伤害程度大。

2.5 不同柠檬香茅资源的抗寒性综合评价

应用隶属函数法对4个柠檬香茅资源各抗寒性生理指标进行综合分析（表5）表明，漳州香茅的抗寒性优于其他3个香茅资源，漳州香茅、永春香茅、新西兰香茅、广东香茅的平均隶属度分别为 0.694 9、0.680 5、0.403 2、0.272 0。平均隶属度综合反映了品种资源的抗寒能力，其值越大则表明抗寒性越强。因此，低温胁迫下4个香茅资源的抗寒性由强到弱依次为漳州香茅>永春香茅>新西兰香茅>广东香茅。

3 讨论与结论

低温使植物组织的细胞膜受损而发生电解质外渗，电导率也随之增大，因此电导率法逐渐广泛应用于植物耐寒性研究[16]。本试验结果表明，随着温度的降低，各香茅品种的相对电导率逐渐增大，说明低温处理对叶片细胞膜造成了伤害，当温度胁迫到-25 ℃时，4个香茅资源的相对电导率相当，这表明4个香茅资源在-25 ℃细胞膜损伤程度相当。低温半致死温度能较直观准确地反映植株的抗寒能力和耐低温的能力，值越低表明抗寒性越强[17]，本试验结果表明，4个柠檬香茅资源的LT50从小到大为漳州香茅、永春香茅、新西兰香茅、广东香茅，温度依次为-21.81、-21.49、-21.13、 -20.94 ℃。该结果可为福建省乃至我国引种香茅资源的选择和抗寒保护提供理论依据。

植物受到低温胁迫时体内活性氧产量增加，细胞膜脂过氧化作用增强，严重时导致细胞受损或植株死亡。 SOD和POD是植物保护酶系统的关键酶类，在植物抵御低温胁迫过程中发挥着重要作用，其活性大小与植物抗寒性强弱有一定的相关性，SOD活性大的种质其抗寒性强。过氧化物酶则通过催化与其他底物发生反应将 H2O2维持在一个较低的水平，防止过量积累，研究表明，抗寒性强的种质过氧化物酶活性高于抗寒性弱的种质[18-19]。本试验显示，随着胁迫温度的降低，SOD与POD活性升高，其中广东香茅和永春香茅的SOD活性比漳州香茅和新西兰香茅要高，但是漳州香茅和新西兰香茅在低温-25 ℃时，活性成倍增加，达极显著水平;从POD活性累积来看，新西兰香茅、漳州香茅的POD活性明显比其余2个品种的活性要高，POD活性的增加，表明抗寒能力增强，可见新西兰香茅、漳州香茅的抗寒性高于其他2个品种。

丙二醛作为膜脂过氧化的最终产物，已经成为衡量植物抗寒性的一个通用指标，丙二醛含量越高，说明植物自身的受害程度越严重，并且在同一温度下，丙二醛含量越高，说明植物抗逆性越差，即丙二醛含量与抗寒性呈负相关[20]。4个香茅资源的丙二醛含量由15 ℃至-25 ℃均表现出上升的态势，且各胁迫温度广东香茅的丙二醛含量明显高于其他3个香茅品种，说明广东香茅的抗寒能力低于其他3个香茅品种;漳州香茅在胁迫的5个温度下，丙二醛含量明显低于其他3个品种，说明漳州香茅的受伤害程度小，而广东香茅的受伤害程度大。

植物是一个统一的有机体，抗寒性是由多因素联合控制的综合性数量性状，各项指标能在一定程度上反映植株抗寒能力，如仅靠一种测定指标难以对其抗寒性进行客观分析。利用隶属函数法进行多指标综合评价是常用的科学方法[21-22]。本研究依据隶属函数值大小评价的抗寒性强弱顺序为漳州香茅>永春香茅>新西兰香茅>广东香茅。

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