阳光毛白杨带芽茎段再生体系的构建

石进朝 陈博 陈兰芬 李彦侠

摘要：以阳光毛白杨带芽茎段为材料，探讨适宜的外植体、消毒方法及6-苄氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和赤霉素（GA3）对增殖生长和吲哚乙酸（IBA）、NAA对生根的影响，并对适宜的瓶苗移栽生根长度、炼苗时期进行研究，构建阳光毛白杨带芽茎段再生体系。结果表明：（1）适宜的外植体为嫩枝带芽茎段及半木质化带芽茎段，发芽率分别达86.7%、63.3%。（2）嫩枝带芽茎段消毒方法是先用90%乙醇（C2H5OH）溶液消毒60 s，再用0.1%氯化汞（HgCl2）溶液消毒 4 min;半木质化带芽茎段消毒方法是先用90% C2H5OH溶液消毒60 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒5 min。（3）适宜的增殖培养基为MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.5 mg/L，适宜的生根培养基为1/2 MS+IBA 0.5 mg/L。（4）炼苗移栽时，适宜的瓶苗根长为1.5～3.5 cm，适宜的炼苗时期为每年的3月，能够获得87.50%的成活率。本再生体系为快速繁育优质阳光毛白杨苗木奠定了基础。

关键词：带芽茎段;增殖;生根;成活率;阳光毛白杨

中图分类号： S722.3+7  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）14-0050-05

毛白杨（Populus tomentosa）是杨柳科（Salicaceae）杨属（Populus L.）白杨派落叶大乔木，是我国北方特有的造林绿化树种。阳光毛白杨是笔者于2015年在北京地区1株雄性毛白杨上发现的芽变体，它的特点是雄性不飞絮，新生叶在整个生长季节为金黄色，老叶渐变绿，为毛白杨的一个彩色变异体。我国北方地区乡土彩色大乔木树种不多，阳光毛白杨的诞生，为我国北方地区城乡绿化，特别是治理飞絮、增彩延绿等提供了新树种。阳光毛白杨扦插成活率低，繁殖系数不高，影响了它的推广与应用。关于毛白杨组织培养快速繁殖，许多学者进行了相关研究，提高了毛白杨的繁殖系数[1-7]。如何在短期内繁殖出优质阳光毛白杨苗木，把这一乡土彩色树种早日应用到首都园林绿化中去，本研究于2019年2月至2020年8月对阳光毛白杨进行带芽茎段再生体系构建的研究，建立阳光毛白杨快繁体系，以期为规模化繁育优质阳光毛白杨苗木奠定基础。1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为一年生阳光毛白杨（Populus tomentosa Sunny）芽变枝条。试验选取阳光毛白杨半木质化带芽茎段、嫩枝带芽茎段作为外植体材料。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体采集与消毒

1.2.1.1 外植体的采集 嫩枝带芽茎段的采集：参照花叶毛白杨外植体培养方法[8]。2019年2月18日从阳光毛白杨芽变枝条，采集芽体饱满、未萌发，生长健壮的一年生枝条，剪成10～12 cm枝段，放入1 000 mL烧杯中水培，置于20～30 ℃有直射光的室内，当其芽萌发长度达到4～5 cm，长出4～6张叶片时，选取其嫩枝带芽茎段作为外植体材料。

半木质化带芽茎段的采集：2019年5月16日在室外露地选取当年生阳光毛白杨枝条上端半木質化带芽茎段作为外植体材料。

1.2.1.2 外植体的消毒 把采集到的阳光毛白杨外植体先用毛刷蘸取少许洗涤灵液，反复轻轻刷洗 5～6次，用蒸馏水充分冲洗干净后，把半木质化枝条及嫩枝剪切成长为1.0～1.2 cm的带芽小段，再用蒸馏水冲洗30 min，在洗涤灵溶液中振荡15 min。先用90%乙醇（C2H5OH）溶液消毒60 s，再用0.1%氯化汞（HgCl2）溶液分别消毒3、4、5、6、7 min，共计设置5个处理。每个处理30个样品。清毒后蒸馏水冲洗6～8次，再用无菌滤纸吸干水分后备用。

1.2.2 初代培养 把经过消毒的阳光毛白杨外植体接种在MS培养基上进行初代培养（图1-a、图1-b），培养室温度为（25±1） ℃，光照度为 2 000～3 000 lx，光照时间为12 h/d。在超净工作台上将无菌外植体接种于100 mL广口瓶中，用封口膜封口。

1.2.3 增殖生长中6-苄氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）及赤霉素（GA3）适宜添加浓度的确定 当初代苗高度达到6～8 cm，接近瓶盖时，以MS为继代增殖基本培养基，在其中加入不同浓度的6-BA（A）、NAA（B）和GA3（C），设置为3个因素，每个因素3个水平，不考虑交互作用，采用L9（34）均匀水平正交试验，共计9个处理，方案设计见表1。

将初代苗切成长为2 cm的带芽小段进行增殖培养，每个处理样品30个，继代25 d后，统计增殖倍数、高度（H）为2.5 cm及以上的增殖苗占比等数据，记录生长势。确定适宜的6-BA、NAA及GA3添加浓度。

1.2.4 生根培养基中，吲哚乙酸（IBA）及NAA适宜的添加浓度的确定 参照变叶金银木的方法[9]。当继代苗生长到高5～6 cm时，以1/2 MS为生根基本培养基，在其中加入不同浓度的IBA及NAA，每个处理30个样品，切取继代苗带芽茎段进行生根培养，25 d 后调查各处理瓶苗的生根数量、根长、根生长势，依此确定添加IBA及NAA的适宜浓度。

1.3 瓶苗生根长度与移栽时期试验

在生根培养25 d后，当阳光毛白杨瓶苗生长高度达5～6 cm，有4～6张正常叶片时，将生长健壮的瓶苗打开瓶口3 d，进行不同生根长度（≤1.5 cm、1.5～3.5 cm、≥3.5 cm）及一年中不同时期（3月12日、7月21日、9月15日及次年的1月20日）的移栽试验。依据移植成活率，确定适宜的移植瓶苗生根长度及一年中适宜的移植时期。

1.4 数据处理

应用SPSS 19.0数据分析软件，对本试验中的数据进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法对外植体发芽率的影响

2种阳光毛白杨的外植体先用90% C2H5OH溶液消毒60 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒处理不同时间。由表2可知，2种阳光毛白杨外植体经不同时间0.1% HgCl2溶液消毒处理后，发芽率差异明显。半木质化带芽茎段的发芽率最高（63.3%）时的消毒时间为 5 min，用0.1% HgCl2溶液消毒7 min时，发芽率为0。可见，半木质化带芽茎段适宜的消毒方法为先用90% C2H5OH溶液处理60 s，再用0.1% HgCl2溶液处理5 min。

嫩枝带芽茎段作为外植体材料经过3～7 min 0.1% HgCl2溶液消毒处理后，最大发芽率为86.7%，其对应的0.1% HgCl2溶液消毒时间为 4 min;随着消毒时间的增加，发芽率明显下降，消毒6～7 min，发芽率降低为0。可见，嫩枝带芽茎段为外植体时，适宜的消毒方法为先用90% C2H5OH溶液处理60 s，再用0.1% HgCl2溶液处理4 min。

2.2 不同浓度的6-BA、NAA及GA3對阳光毛白杨瓶苗增殖生长的影响

在MS基本培养基中分别加入不同浓度的6-BA、NAA和GA3，设置为3个因素，每个因素3个水平，采用L9（34）的均匀水平正交试验，共计9个处理。选择生长健壮，高度≥2.5 cm的初代苗，将其剪切成1.0 cm的带芽茎段，进行接种，25 d后平均增殖倍数、增殖苗高度（H）≥2.5 cm百分比及生长势见表3，方差分析结果见表4、表5。

由表3可知，在MS基本培养基中分别加入不同浓度的6-BA、NAA、GA3，培养25 d后均能诱导出继代增殖苗，增殖倍数为2.39～4.62，增殖苗高度（H）≥2.5 cm的百分比为11.3%～86.3%。结合表4、表5中方差分析结果可以看出，6-BA浓度对阳光毛白杨瓶苗增殖倍数和瓶苗高度均有极显著影响，而NAA和GA3的浓度变化对其影响不显著。较高浓度（0.3 mg/L）的6-BA对阳光毛白杨瓶苗的增殖生长有明显的促进作用，表现为增殖倍数高，苗木生长健壮（图2）;随着6-BA浓度的增加，丛生芽颜色有发黄迹象，玻璃化明显增多，长势变弱。依据增殖培养25 d后的平均增殖倍数、增殖苗高度（H）≥2.5 cm的百分比及增殖苗生长势3项指标综合来看，阳光毛白杨瓶苗增殖生长时，适宜的6-BA、NAA及GA3浓度分别为0.3、0.05、0.5 mg/L。即阳光毛白杨瓶苗增殖生长适宜的培养基为MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.5 mg/L。

2.3 不同浓度IBA及NAA对瓶苗生根的影响

以1/2 MS为阳光毛白杨瓶苗生根基本培养基，在其中添加不同浓度的IBA（0.3、0.5、0.8、1.0 mg/L）及NAA（0.5、0.8、1.0、1.5 mg/L）。当继代苗生长高度为5～6 cm，接近瓶盖时，将其剪切成1.0 cm的带芽茎段接种，进行生根培养，25 d后调查瓶苗单株平均生根数量、生根长度、根生长势，结果见表6。由表6可知，不同浓度IBA对阳光毛白杨继代苗生根长度影响差异显著，在IBA浓度为 0.3～1.0 mg/L范围内，单株平均生根数量呈正态分布，在0.5 mg/L时达最大值，为8条;平均生根长度与IBA浓度无明显相关性。根生长势表现为在IBA浓度为1.0 mg/L时，基部有愈伤组织形成，根少而短;IBA浓度为 0.8 mg/L 时，瓶苗生根少，单株平均3条，根细长，长势弱;在IBA浓度为0.5 mg/L时，第20天开始生根，生根快，数量多，达8条，根生长势健壮。IBA浓度为0.3 mg/L时，生根慢，数量少，为2条，根细长。

当NAA浓度为1.0、1.5 mg/L时，阳光毛白杨继代苗有少量生根，单株平均生根数量分别为2、3条，平均生根长度小，根少而细长。显示出IBA比NAA更有利于阳光毛白杨瓶苗生根，有促进瓶苗生根的作用。

从瓶苗的平均生根数、根长、根生长势3项指标综合来看，阳光毛白杨瓶苗生根时，适宜的IBA添加浓度为0.5 mg/L，即适宜的生根培养基为 1/2 MS+IBA 0.5 mg/L。

2.4 影响阳光毛白杨瓶苗移栽成活率的因素

植物瓶生根苗炼苗移栽成活率受多种因素影响，如开瓶炼苗时间、生根苗地径[8-9]、栽培基质及光照、温湿度等环境控制因子直接决定着炼苗成活率。

2.4.1 不同瓶苗生根长度对生根瓶苗移栽成活率的影响 瓶苗的生根长度及根的健壮程度与移栽成活率密切相关。把经过开口3 d的阳光毛白杨生根瓶苗，选择基径≥0.8 mm的苗，洗去培养基，按不同生根长度（≤1.5 cm、1.5～3.5 cm、≥3.5 cm），在智能温室内移栽到穴盘中，以蛭石与珍珠岩混合物（体积比为3 ∶ 1）作基质。环境控制为初期保持70%～80%的相对空气湿度，温度控制在20～30 ℃，适当遮阴，每隔10 d喷1次80%多菌灵800倍液，连喷3次，30 d后调查成活株树、苗木生长势，统计成活率，结果见表7。

苗木根系过长，如根长≥3.5 cm时进行移栽，须要对苗木进行修根处理，会造成伤根现象;苗木根系过短，如根长≤1.5 cm时进行移栽，由于苗木根系幼嫩，移栽时也会成伤根，苗木根系过长或过短，都会影响移栽成活率。由表7可知，不同生根长度的阳光毛白杨生根瓶苗移栽到穴盘中的成活率呈现正态分布，根长为1.5～3.5 cm时成活率最高，为87.50%，根长≥3.5 cm的成活率次之（62.22%），根长≤1.5 cm时，成活率最低（45.83%）。可见，在进行阳光毛白杨生根瓶苗移栽时，适宜的瓶苗根长为1.5～3.5 cm。

2.4.2 不同移栽炼苗时期对生根瓶苗移栽成活率的影响 分别在一年中的3月12日、7月21日、9月15日及次年的1月20日，把已打开瓶口3 d，选用基径≥0.8 mm、根长1.5～3.5 cm的阳光毛白杨生根瓶苗，移栽到装有蛭石的穴盘中，环境控制同“2.4.1”节，成活率见表8。

一年中不同炼苗时期对苗木成活率的影响，实质上是温度、湿度等环境条件对苗木成活率的影响。由表8可知，在7月21日移栽炼苗时，成活率较低（48.61%），这时候气温高，湿度大，苗木容易染病，成活率低;在1月20日移栽炼苗时，这时候是一年中最冷的时期，成活率最低（38.89%）;在3月12日、9月15日，这时候室外温湿度适宜，移栽成活率较高（图3），分别为87.50%、81.94%。在进行阳光毛白杨生根瓶苗移栽时，一年中适宜的炼苗时间为3月和9月。3月炼苗时，培养30 d后，生根苗高度为15～20 cm（图4），即可移栽到大田继续培养成大苗，不需要在温室中越冬;9月炼苗时，需要在温室中越冬不能露地栽培，从节约成本方面考虑，阳光毛白杨适宜的炼苗移栽时期为3月。

3 讨论与结论

3.1 讨论

3.1.1 提高阳光毛白杨外植体诱导率的途径 阳光毛白杨腋芽密被白色绒毛，消毒不易，易出现消毒过度或消毒不徹底等现象，尤其是从室外采集的半木质化带芽茎段，消毒灭菌困难，要么全部杀死，要么污染严重。本试验选择室内水培阳光毛白杨萌枝上嫩枝带芽茎段作为外植体，与变叶金银木组织培养外植体选择一样[9]，获得了较高的诱导成活率，探索出了阳光毛白杨嫩枝带芽茎段及半木质化带芽茎段适宜的消毒灭菌方法，为规模化快速繁育优质阳光毛白杨苗木奠定了基础。

3.1.2 激素对阳光毛白杨组培体系构建的影响 生长调节剂是组织培养中诱导植物形态建成的主要因素[10-11]，细胞分裂素在植物增殖中起着重要的作用，6-BA常与其他调节剂组合诱导不定芽产生和促进植物增殖[12]。本试验结果显示，增殖率在一定的 6-BA浓度范围内呈上升趋势，较低浓度的 6-BA 促进茎段不定芽的增殖，而达到最佳的浓度后，再增加 6-BA 的浓度则表现为抑制不定芽的诱导，同时外植体玻璃化的趋势加重。所以在实际操作中6-BA浓度不宜过高，否则会抑制外植体的整体生长。IBA及NAA在生根诱导中使用广泛，通常较低浓度的生长素有利于外植体生根，浓度过高会产生抑制效果，本研究得出了相似的结果。NAA除了促进生根外还能促进发芽，而IBA诱导生根的作用较强且发根数量较大，根系较粗壮。

3.2 结论

嫩枝带芽茎段是阳光毛白杨再生体系适宜的外植体材料，发芽率达86.7%。半木质化带芽茎段也可作为阳光毛白杨外植体材料，诱导出腋芽的发生，发芽率为63.3%。嫩枝带芽茎段适宜的消毒方法为先用90% C2H5OH溶液消毒60 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒 4 min;半木质化带芽茎段适宜的消毒方法为先用90%C2H5OH溶液消毒60 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒5 min。阳光毛白杨再生体系适宜的增殖生长培养基为MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.5 mg/L，适宜的生根培养基为1/2MS+IBA 0.5 mg/L。生根苗移栽炼苗时，适宜的生根瓶苗的根长为1.5～3.5 cm，适宜的炼苗时期为每年的3月，能够获得87.50%的成活率。

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