苦荞二磷酸尿核苷-半乳糖转运载体FtUTR的鉴定与分析

石桃雄 汪燕 梁成刚 韦春玉 关志秀 黄娟 朱丽伟

摘要：植物二磷酸尿核苷-半乳糖转运蛋白（UDP-galactose transporter，UTR）参与介导UDP-半乳糖的跨膜运输，对于高尔基体内非纤维素多糖和糖蛋白合成至关重要。为了给苦荞糖运输及调控机制研究提供科学参考，本研究基于基因功能注释与同源基因比对，鉴定到9个苦荞FtUTR基因，其序列长度在1 920～5 975 bp间，氨基酸残基在 81～352个间。FtUTR氨基酸序列的一致性为19.14%，说明苦荞不同FtUTR蛋白间序列保守性较低。但多个苦荞FtUTR可分别与同源的拟南芥AtUTR聚在一起，说明不同物种间UTR蛋白的进化关系较为紧密。基于茎的转录组测序鉴定到5个差异表达基因（DEGs），其中FtPinG0001931200.01在出苗后5 d高表达;FtPinG0001901300.01和FtPinG0002689200.01在出苗后10 d高表达;FtPinG0001931400.01和FtPinG0001052700.01在出苗后15 d高表达，推测它们可能在幼苗的特定发育阶段发挥作用。另外，幼苗发育过程中苦荞DEGs的表达量存在多个显著正相关或负相关关系。本研究结果可为下一步深入探索苦荞FtUTR调控UDP-半乳糖运输以及生长发育提供基础。

关键词：苦荞;二磷酸尿核苷-半乳糖转运体;蛋白序列分析;基因表达

中图分类号：S517.01   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）15-0053-05

收稿日期：20201-04-14

基金项目：国家自然科学基金 （编号：32060511）;贵州省科技支撑计划 （编号：黔科合ZC[2019]2298）;贵州省高层次创新型人才“千层次人才”项目;贵州省荞麦种质资源保育及创新重点实验室建设基金（编号：黔教合KY[2017]002）;贵州省研究生教育创新计划 （编号：黔教合YJSCXJH[2020]100）。

作者简介：石桃雄（1980—），女，宁夏石嘴山人，博士，副教授，研究方向为荞麦数量遗传学，E-mail：shitaoxiong@126.com;共同第一作者：汪 燕（1985—），女，重庆人，博士，副教授，研究方向为荞麦种质资源创新与遗传育种，E-mail：yanwanguf@163.com。

通信作者：梁成刚，博士，副教授，研究方向为荞麦遗传育种。E-mail：jesselcg@163.com。

二磷酸尿核苷-半乳糖（UDP-galactose）是植物高尔基体内非纤维素多糖和糖蛋白合成的重要前体物质[1-2]。UDP-半乳糖转运蛋白（UDP-galactose transporter，UTR）则是介导UDP-半乳糖进行跨膜运输的重要载体，对于植物的生长发育具有重要作用[3-4]。Khalil等将人类的UDP-半乳糖转运体基因hUGT1导入烟草，结果发现转基因烟草植株表现出类似于外源赤霉素喷施的形态特征[5]。Reyes等研究指出，拟南芥中UDP-半乳糖转运体AtUTr1定位于内质网，体外试验证实AtUTr1能够参与UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖运输[6]。此外，Bakker等鉴定获得2个拟南芥UDP-半乳糖转运体基因（UDP-GalT1和UDP-GalT2），互补试验证实它们具有UDP-半乳糖底物特异性[7]。Rollwitz等则在拟南芥中鉴定到一个新的UDP-半乳糖蛋白AtNST-KT1[8]。Handford等研究发现，拟南芥AtUTr7调控了UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖的运输，进而影响侧根的发育[9]。Seino等基于拟南芥UDP-galactose transporter序列比对，鉴定到水稻同源基因，并克隆了4个OsUGT基因，分别编码350、337、345和358个氨基酸残基[10];互补试验证实OsUGT1、OsUGT2、OsUGT3可参与介导UDP-半乳糖的运输，而OsUTG4则介导了UDP-葡萄糖的运输。苏莹等基于同源比对鉴定到具有UDP-半乳糖和UDP-鼠李糖转运活性的水稻OsURGT1，氨基酸残基数为331个，可能参与多种激素调控途径和逆境胁迫调控途径[11]。

苦荞是我国的特色杂粮作物，主要种植于西南高寒地区[12]。苦荞生育期短，同时具有耐贫瘠、耐冷凉、耐干旱等特性，加之其营养保健功能突出，深受人们的喜爱[13-14]。不過，作为一种小宗作物，苦荞栽培驯化时间短，基础研究开展较为滞后，开展与苦荞糖运输及调控机制的相关研究工作，可为探索苦荞生长发育与产量形成提供科学参考。本研究首次对苦荞UDP-半乳糖转运基因家族FtUTR基因进行筛选、鉴定与生物信息学分析，明确FtUTR基因信息及编码蛋白理化特性、系统发育关系，并结合转录组测序分析苦荞FtUTR的表达模式等，为苦荞糖类运输的分子调控机制等相关研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

基于拟南芥TAIR基因库（https：//www.arabidopsis.org/about/datasources.jsp）中查询获得的AtUTR基因序列和苦荞转录组测序数据库的基因功能注释，进行序列同源比对，筛选并鉴定苦荞FtUTR基因。

1.2 苦荞FtUTR基因及编码蛋白的序列分析

登陆NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）进行苦荞FtUTR基因的最长开放阅读框编码蛋白（MaxORF）及编码蛋白的氨基酸序列预测。登陆Expasy网站（https：//web.expasy.org/protparam/）进行苦荞FtUTR编码蛋白的氨基酸残基数、蛋白分子质量、等电点、疏水性和脂肪族氨基酸指数的预测。登陆蛋白结构预测网站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）进行苦荞FtUTR蛋白的跨膜结构功能域预测。利用DNAman软件分析FtUTR氨基酸序列的保守位点。利用MEGA 5.0软件Cluster W进行FtUTR氨基酸序列多重序列比对分析，使用Neighbor-joining法进行蛋白聚类分析，重复次数设置为1 000次。

1.3 苦荞FtUTR基因的表达与相关性分析

试验于2018年在贵州省荞麦工程技术研究中心基地进行，在苦荞出苗后5、10、15 d对基部茎进行转录组测序和基因表达分析，并鉴定差异表达基因（DEGs）。利用MeV软件制作FtUTR基因的表达量热图，SPSS 19.0进行FtUTR基因表达量的相关性分析。

2 结果与分析

2.1 苦荞FtUTR基因及蛋白序列分析

基于转录组测序的基因功能注释与拟南芥AtUTR序列比对筛选到9个同源苦荞FtUTR基因。如表1所示，苦荞FtUTR序列在1 920～5 975 bp间，MaxORF的氨基酸残基在81～352个间，分子量在8 780.03～39 287.30 u间，等电点在4.88～980间，疏水性在-0.200～0.728间，脂肪族氨基酸指数在72.35～111.03间。跨膜结构域预测发现6个FtUTR的MaxORF跨膜结构域在2～8个间，3个FtUTR的MaxORF蛋白不含有跨膜结构域。

对苦荞FtUTR的MaxORF蛋白序列进行比对分析，结果发现9个苦荞FtUTR的MaxORF蛋白序列一致性仅为19.14%。如图1所示，9个蛋白间不存在完全共同保守位点，仅存在19个相对保守位点，说明FtUTR间氨基酸序列差异较大。

2.2 苦荞FtUTR蛋白序列分析

利用拟南芥AtUTR蛋白序列与苦荞FtUTR蛋白序列进行聚类分析，由图2可知，拟南芥UTR1、UTR3与苦荞FtPinG0001052700.01、FtPinG0001901300.01被聚为一小类;拟南芥UTR2与苦荞FtPinG0001931400.01、FtPinG0006716700.01被聚为一小类;拟南芥UTR6与苦荞FtPinG0006904300.01被聚为一小类;拟南芥UTR7与苦荞FtPinG0003694100.01被聚为一小类;另外，苦荞FtPinG0007731500.01、FtPinG0002689200.01和FtPinG0001931200.01被聚为一小类。

2.3 苦荞茎发育过程中FtUTR基因的表达分析

基于转录组测序，检测到9个FtUTR基因在苦荞出苗后5、10、15 d茎中均有表达，DEGs鉴定发现5個FtUTR基因在不同时期茎中差异表达。由图 3-A 可知，不同时期茎FtUTR基因的表达量变化趋势不一致，主要存在表达量逐渐升高、逐渐降低、先升高后降低以及相对变化幅度较小的4种变化类型。由图3-B可知，1个苦荞FtUTR差异表达基因（FtPinG0001931200.01）在出苗后5 d高表达;2个苦荞FtUTR差异表达基因（FtPinG0001901300.01和FtPinG0002689200.01）在出苗后10 d高表达;2个苦荞FtUTR差异表达基因（FtPinG0001931400.01和FtPinG0001052700.01）在出苗后15 d高表达，推测不同FtUTR基因可能在茎的特定发育阶段发挥功能。

2.4 苦荞FtUTR基因的相关性分析

对不同时期苦荞茎FtUTR基因的表达量进行

相关性分析，由表2可知，FtPinG0001931200.01与FtPinG0001052700.01、FtPinG0001931400.01呈显著或极显著负相关关系;FtPinG0002689200.01与FtPinG0001901300.01呈极显著正相关关系，与FtPinG0001052700.01、FtPinG0001931400.01呈显著或极显著负相关关系;FtPinG0001901300.01与FtPinG0001052700.01、FtPinG0001931400.01呈极显著负相关关系;FtPinG0001052700.01与FtPinG0001931400.01呈极显著正相关关系。

3 讨论与结论

植物UTR蛋白介导的UDP-半乳糖跨膜运输对非纤维素多糖和糖蛋白合成具有重要作用[1-3，15]。基于拟南芥UTR序列，在作物中陆续开展了同源基因的相关研究。例如Seino等克隆得到了水稻OsUGT1、OsUGT2、OsUGT3、OsUGT4，分别编码350、337、345、358个氨基酸残基[10]。本研究基于转录组测序的基因功能注释与拟南芥UTR同源基因进行比对，筛选到9个苦荞FtUTR基因。其中，FtPinG0001052700.01、FtPinG0003694100.01、FtPinG0001931400.01FtUTR基因分别编码332、339、352个氨基酸残基，其余6个FtUTR基因的最长开放阅读框编码氨基酸序列较短。跨膜结构预测发现，氨基酸序列较长的FtUTR蛋白含有多个跨膜结构域，虽然3个FtUTR基因的MaxORF不存在跨膜结构域，不过它们的其他ORF编码蛋白含有跨膜结构域，因此，推测9个苦荞FtUTR基因均能介导跨膜运输。

Seino等指出植物中存在多个UDP-半乳糖转运基因，但相互间进化关系并不紧密[10]。本研究发现，苦荞9个FtUTR蛋白间序列一致性仅为1914%，且不存在完全共同保守位点，仅含19个相对保守位点，说明苦荞不同FtUTR蛋白间序列保守性较低。不过，多个拟南芥AtUTR与苦荞FtUTR被聚在一起，例如拟南芥AtUTR2与苦荞FtPinG0001931400.01、FtPinG0006716700.01被聚为一小类，说明不同物种间UTR蛋白的进化关系较为紧密。

本研究发现苦荞茎不同发育时期9个FtUTR基因表达量变化趋势不一致，基于转录组差异基因分析共鉴定到5个DEGs，其中FtPinG0001931200.01在出苗后5 d高表达;FtPinG0001901300.01和FtPinG0002689200.01在出苗后10 d高表达;FtPinG0001931400.01和FtPinG0001052700.01在出苗后15 d高表达。苦荞出苗后5 d，幼苗正处于子叶期，营养物质由地下种子向地上部分运输，10 d时幼苗正逐步完成由子叶期向真叶期的过渡，而 15 d时植株则完全进入真叶期，因此，推测这些FtUTR可能在幼苗的特定发育阶段发挥作用。另外，4个FtUTR基因在茎不同发育时期表达量无明显变化，表明它们可能在幼苗发育过程中持续发挥作用。相关性研究发现，苦荞中FtUTR基因中5个DEGs间存在多个显著正相关或负相关的关系，而其余4个FtUTR基因与其他FtUTR基因间不存在显著性相关，说明这些DEGs间可能协调发挥功能或相互间存在功能互补现象。本研究为下一步深入探索苦荞FtUTR调控UDP-半乳糖运输以及生长发育提供了基础。

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