高效液相色谱法同时测定黄芩茎、叶、花中野黄芩苷含量

王云龙，刘春生，陈立柱，房 岐

（1.黑龙江省鸡西市食品药品检验检测中心，黑龙江 鸡西158100；2.北京中医药大学中药学院，北京100102）

黄芩为大宗药材，源于唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根，用于治疗各种热证和湿证[1]，采收时仅保留地下主根作为药用部位，地上部分茎、叶、花往往当作废弃物处理，造成大量资源浪费。野黄芩苷是黄芩地上部分的主要成分[2－3]，具有抗肿瘤[4]、神经保护[5]、抗炎[6－7]等药理作用，目前尚无同时测定黄芩茎、叶、花中野黄芩苷含量的研究。本研究中建立了同时测定黄芩茎、叶、花中野黄芩苷含量的高效液相色谱法，为其质量标准的制订和进一步开发利用提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC2010 A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；XPE205型电子天平（德国Mettler Toledo公司，精度为0.01 mg）；XM－300UVF型智能静音超声波清洗机（小美超声仪器有限公司，功率为300 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

野黄芩苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号为Y24F11Y16967，纯度为98.0%）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；黄芩茎、叶、花3批样品均采自黑龙江省鸡西市黄芩栽培基地，采集时根据种植面积平均分为3个区域，每个区域随机采取2株，共6株。样品采集后，每株分别摘取叶和花，除去杂质，干燥，得干燥叶和花；茎切段，干燥，得干燥茎。所得样品经鸡西市食品药品检验检测中心杨立志主任药师鉴定为黄芩的干燥茎、叶和花。样品来源及相关信息见表1。

表1 样品来源及相关信息Tab.1 Sources and related information of the samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）－0.4 %磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～15 min时35%A，15～25 min时35%A～80%A，25～32 min时80%A～35%A，32～35 min时35%A）；流速：1.0 mL／min；检测波长：335 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

取野黄芩苷对照品24.88 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，即得质量浓度为243.82 μg／mL的对照品贮备液，精密吸取4 mL，置10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，混匀，即得质量浓度为97.53 μg／mL的对照品溶液。分别取3号样品的茎、叶、花，研成细粉，过4号筛，取茎粉末0.50 g、叶粉末0.13 g、花粉末0.25 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，密塞，静置30 min，超声处理（功率为300 W，频率为40 kHz）30 min，放冷，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。取缺黄芩茎、叶、花的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照药材溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照药材溶液各适量，按2.1项下色谱条进样测定。结果供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处有相应色谱峰出现，阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图1.scutellarinA.Test solution（stem）B.Test solution（leaf）C.Test solution（flower）D.Reference solution E.Negative reference medicinal material solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取2.2项下对照品贮备液1，2，4，6，8，10 mL，分别置10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，摇匀，得系列质量浓度的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标、对照品溶液质量浓度（X，μg／mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y＝25 881X＋93 582(r＝0.999 9，n＝6）。结果表明，野黄芩苷质量浓度在24.38～243.80 μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取黄芩叶(3号样品)，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次。结果野黄芩苷峰面积的RSD为0.31%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取黄芩叶（3号样品）0.13 g，精密称定，共6份，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。结果野黄芩苷含量的RSD为1.53%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取黄芩叶（3号样品），依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，16，24，48 h时按2.1项下色谱条件进样测定。结果野黄芩苷峰面积的RSD为0.92%（n＝7），表明供试品溶液在48 h内稳定。

加样回收试验：取已知含量的黄芩叶（3号样品）粉末65 mg，精密称定，共6份，分别置50 mL容量瓶中，精密加入2.2项下对照品贮备液10 mL，用70%乙醇定容，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 黄芩叶中野黄芩苷加样回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of the recovery test of scutellarin in the leaves of Scutellaria baicalensis(n＝6)

2.4 样品含量测定

分别取3批黄芩茎、叶、花，各3份，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，采用外标法计算野黄芩苷的含量，结果见表3。可见，黄芩茎、叶、花中野黄芩苷含量由高至低依次为叶、花、茎，叶中野黄芩苷的含量为茎或花的2～3倍。3批样品中野黄芩苷含量差异不大，表明生长年限对黄芩茎、叶、花中野黄芩苷含量的影响不显著。

表3黄芩茎、叶、花中野黄芩苷含量测定结果（%，n＝3）Tab.3 Content determination of scutellarin in the stems，leaves and flowers of Scutellaria baicalensis（%，n＝3）

3 讨论

在前期试验中发现，采用高效液相色谱法测定时，黄芩茎、叶、花中野黄芩苷色谱峰的信号较强，故选择野黄芩苷为检测指标。考察了不同提取方法（70%乙醇超声提取、70%乙醇回流提取、甲醇超声提取、甲醇回流提取）对含量测定结果的影响，结果以70%乙醇为提取溶剂时，先静置30 min，再超声处理30 min，黄芩茎、叶、花中野黄芩苷的含量最高，考虑超声提取法简便，故选择70%乙醇超声提取。通过扫描紫外光谱发现，在335 nm波长下有最大吸收，故选择335 nm为检测波长。

前期试验中发现，不同样品黄芩叶含量差异较大，考虑其化学成分可能受生长时间和不同生长部位等因素影响，故仅选择黄芩叶样品进行方法学考察。黄酮类化合物多显弱酸性，易解离，影响分离效果，采用离子抑制色谱法加入一定量磷酸，通过梯度洗脱，各色谱峰分离较好。

测定样品含量时发现，叶中野黄芩苷的含量为茎或花的2～3倍，提示今后制订黄芩茎、叶、花的质量标准时，应充分考虑茎、叶、花的质量比例。生长年限对黄芩茎、叶、花野黄芩苷含量的影响不显著，其原因可能与每年秋季对茎、叶、花割秧或焚烧处理使次年发新枝叶有关。

综上所述，本方法操作简便，专属性强，准确度高，重复性好，可用于黄芩茎、叶、花中野黄芩苷的含量测定，可为今后黄芩地上部分质量标准的制订和进一步开发利用提供依据。