阿特拉津胁迫对谷子种植区土壤真菌群落的影响

蔡颖慧，黄潇，赵小珍

（1.山西省生物研究院有限公司，山西 太原 030006；2.山西省科技资源与大型仪器开放共享中心，山西 太原 030006）

农药的使用大幅减少了病虫害的发生，但农药的广泛使用也是导致生态环境污染、土壤生物学质量退化的最重要人为因素之一。农药污染不仅改变了土壤的理化性质，导致土壤酸化，而且对土壤微生物、土壤质量和可持续利用具有严重危害［1，2］。土壤真菌是土壤生态系统的重要组分之一，具有分解有机质、土壤酶释放、抑制病原菌等重要作用，是土壤中氮、碳循环的必要动力。真菌可降解复杂化合物，与作物共生形成菌根，对促进植物生长、维持农业生态系统的稳定具有重要意义［3，4］。

阿特拉津又称莠去津，是一种内吸选择性苗前、苗后除草剂，可防除多种一年生禾本科和阔叶杂草，对某些多年生杂草也有一定抑制作用。由于阿特拉津杀草谱广，价格低廉，使用效果好，在很多国家被广泛应用于玉米、甘蔗、果树及谷物类作物生产中，是世界产量最大的除草剂之一。阿特拉津的结构比较稳定，降解速度缓慢，其在土壤中的残留半衰期为28～440 d。已有研究表明，阿特拉津可明显降低土壤真菌的数量，对土壤真菌功能多样性和遗传多样性产生影响［5－8］。近几年来，高通量测序技术的快速发展，大大拓宽了微生物的研究范围。Illumina MiSeq第二代测序技术，可以更直接地检测微生物类群，广泛用于医学、农学、食品等领域［9－11］。样本的多样性分析可反映微生物群落的丰富度和多样性。

目前对阿拉特津的研究多集中在降解方面，关于其对土壤中真菌多样性的影响少有研究。本试验通过构建不同污染浓度的土壤模型，采用高通量测序技术，揭示阿特拉津对山西谷子种植区土壤真菌群落的影响，为进一步探讨农药对土壤真菌群落结构的影响提供基础，对黄土高原谷子种植过程中阿拉特津用量及使用后土壤生态环境修复具有一定的理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验地位于山西省阳曲县定点试验田，地势平坦，属暖温带大陆性季风气候，年平均气温6～9℃，年平均降水量为441.2 mm，无霜期为164 d左右。土壤类型为山西黄土，供试作物为谷子（Setaria italica）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 采用裂区试验设计，共4个处理，每个处理重复3次，每个重复小区面积为33 m2。2017年6月上旬至7月上旬、谷子3～4叶期用38%阿特拉津水悬浮剂喷雾两次，药剂用量为2、5、8 L／hm2，对照处理喷施清水［12］。

1.2.2 土壤理化性质测定 2017年9月，采用五点取样法采集2～20 cm表层土样。过2 mm筛子，去除杂草、碎石等杂质，4℃保存待用。部分土样自然风干，用于土壤基本理化性质测定。每个样品3次重复。土壤pH测定采用酸度计法；含水量测定根据国家标准LY／T1213—1999（烘干法）；有机质的测定采用重铬酸钾消煮－硫酸亚铁滴定法；有机氮的测定采用Bremner酸解法；有效磷的测定采用浸提－钼锑抗比色法；速效钾的测定采用原子吸收火焰光度法［13］。

1.2.3 土壤DNA的提取及ITS基因测序 称取0.5 g土壤样品，采用基因组DNA快速抽提试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取土壤DNA；得到的DNA溶解于50～100μL TE Buffer中，－20℃保存。选择ITS2可变区，以5～50 ng DNA为模板，PCR扩增真菌ITS rDNA。使用2%琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳检测，胶回收试剂盒回收产物。构建DNA文库，Qubit和实时定量PCR检测合格后，通过Illumina MiSeq上机测序［14］。

1.3 数据分析

对高通量测得的序列进行聚类，以97%的相似度将序列归为同一分类操作单元OTUs（operational taxonomic units），ITS rDNA进行比对（参考数据库是Unit数据库：https：／／unite.ut.ee／），然后对OTUs的代表序列进行物种注释分析（Ribosomal Database Project），确定ITS2序列对应真菌，并分析不同物种分类水平下各样本的群落组成。基于OTUs的分析结果，对样本序列随机抽样，采用Qiime 1.9.1计算土壤真菌α多样性指数（Chao1、Shannon、ACE等）。原始数据利用Galaxy平台（http：／／mem.rcees.ac.cn：8080）进行分析，以获得土壤微生物群落优势类群的相对丰度［15］。

2 结果与分析

2.1 供试土壤理化性质

由表1可知，4种处理的土壤pH值无显著差异；除5 L／hm2处理的速效钾含量外，喷施阿特拉津的土壤含水量和有机质、有效磷、速效钾、有机氮含量均低于对照。

表1 供试土壤理化性质

2.2 土壤测序结果及真菌α多样性分析

由表2可知，测序共获得325 110个真菌有效序列，依据97%的相似度，真菌OTUs数为358～502。本次测序的覆盖率均在99%以上，说明测序结果较好地反映了土壤样本中真菌群落组成的真实情况。对照土壤获得的OTUs数目最多，其次是2 L／hm2和5 L／hm2，8 L／hm2的最低。Chao1指数表现为对照＞5 L／hm2＞2 L／hm2＞8 L／hm2，ACE指数表现为对照＞2 L／hm2＞8 L／hm2＞5 L／hm2，结合Shannon指数和Simpson指数可知，随着阿特拉津浓度的增加，土壤真菌多样性降低，物种丰富度降低。

表2 不同浓度阿特拉津胁迫下土壤真菌α多样性指数

利用Venn图统计多个样本中的OTUs数，可以直观地显示喷施不同浓度阿特拉津后土壤真菌组成的差异性和重叠程度。4种土壤样本共有的OTUs数为138个，占各土壤样本的27%～39%。4种土壤样本特有的OTUs数目及其所占比例分别为对照86个（17.13%），2 L／hm268个（14.95%），5 L／hm249个（13.14%），8 L／hm221个（5.87%）（图1）。这表明喷施不同浓度阿特拉津土壤间真菌群落组成相似，但仍存在部分差异。

图1 不同浓度阿特拉津胁迫下土壤真菌Venn图

2.3 不同浓度阿特拉津胁迫下土壤真菌群落组成

由图2可以看出，土壤真菌主要门类为子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）和球囊菌门（Glomeromycota），5个门的相对丰度分别为61.9%、12.5%、6.8%、1.9%和0.9%，未明确分类真菌（unidentified）也占有较高比例（16.2%）。阿特拉津处理组与对照组相比，接合菌门相对丰度变化不大；担子菌门和球囊菌门的相对丰度在对照土壤中高于喷洒阿特拉津的土壤。在黄土高原谷子种植区，子囊菌为土壤真菌的优势菌门。对照土壤以及喷洒浓度为2 L／hm2阿特拉津的土壤中子囊菌门相对丰度大于5 L／hm2和8 L／hm2的土壤；对照土壤中真菌多样性更为丰富。未明确分类真菌中，相对丰度表现为对照＜2 L／hm2＜5 L／hm2＜8 L／hm2。

图2 土壤真菌门水平下优势物种的相对丰度

为深入研究不同浓度阿特拉津胁迫下土壤真菌群落物种组成情况，进一步考察了样品中土壤真菌在纲水平和属水平的优势物种相对丰度。如图3所示，4种土壤样品中真菌纲水平的优势物种主要有伞菌纲（Agaricomycetes）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、锤舌菌纲（Leotiomycetes）、散囊菌纲（Eurotiomycetes）、丝孢纲（Hyphomycetes）和球囊菌纲（Glomeromycetes）。4种土壤样品中，伞菌纲的相对丰度最高，占所有真菌纲的18.6%～27.7%；其次为粪壳菌纲，相对丰度占所有真菌纲的14.7%～19.1%；真菌纲水平下优势物种相对丰度对照＞2 L／hm2＞5 L／hm2＞8 L／hm2。

图3 土壤真菌纲水平优势物种的相对丰度

各土壤样品中真菌优势属的相对丰度如表3所示。喷施不同浓度阿特拉津的土壤真菌属水平的相对丰度差异显著，10种优势属绝大部分属于子囊菌门。4种土壤样品中，青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）相对丰度最高，可达到11.71%～20.22%，其次是拟青霉属（Paecilomyces）。土壤真菌优势属相对丰度均随着阿特拉津浓度的增高而降低，但是在较低浓度阿特拉津胁迫下，土壤中漆斑菌属真菌相对丰度会有所提高，2 L／hm2阿特拉津胁迫下，土壤中漆斑菌属真菌相对丰度可达1.86%，5 L／hm2条件下为1.06%，而对照组、8 L／hm2条件下分别为0.08%和0.05%。

表3 土壤真菌优势属的相对丰度 （%）

3 讨论与结论

本研究结果表明阿特拉津胁迫会导致土壤含水量、有机质、有效磷、速效钾、有机氮等理化性质改变。目前相关研究已证实，除草剂的长期使用对速效磷、速效钾、速效氮、有机质含量均有影响，而土壤理化性质改变又会进一步影响土壤微生物群落结构［16－18］。对照土壤真菌多样性指数高，说明对照土壤中真菌多样性更为丰富。分析其原因，一方面由于对照不喷洒阿特拉津，杂草生长相对旺盛，更具有多样性。杂草是加强地上地下生态系统的密切联系者，杂草多样性一定程度上改变了土壤碳氮比，从而进一步影响土壤微生物群落结构［19］。另一方面，由于避免了农药的使用，本身降低了农药对土壤部分真菌的毒害，使其能够更好地利用土壤中易降解部分及养分，从而促进其增殖，同时间接影响其他土壤真菌［20］。

在低浓度阿特拉津胁迫下，谷子种植区土壤中漆斑菌属真菌相对丰度有所提高。漆斑菌多寄生、腐生，能够产生胆红素氧化酶，在受到环境污染后可产生应急反应，导致活性增加。较低浓度的阿特拉津诱导漆斑菌活性的提高，从而提高了漆霉菌属在土壤中的优势度和生态位，增加了其相对丰度［21］。

在一定范围内，阿特拉津喷洒浓度越高，土壤真菌丰度和多样性越低；阿特拉津可导致土壤中真菌的丰富度和群落多样性降低，但不会改变土壤中优势真菌种类。本研究可为今后探讨除草剂对土壤及真菌群落结构的影响提供依据。