基于高通量测序分析海南粗榧树皮和叶片中微生物多样性

赵德庆，于平，乔飞

（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所／农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室，海南 儋州 571737）

海南粗榧（Cephalotaxus hainanensisLi.）为三尖杉科（Cephalotaxaceae）三尖杉属孑遗植物，主产中国海南省，是三尖杉属分布最南的种，属于我国特有的珍稀药用植物［1，2］。其含有三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、异三尖杉酯碱和脱氧三尖杉酯碱等具有抗癌活性的三尖杉酯类生物碱成分，其中高三尖杉酯碱和三尖杉酯碱已成为治疗白血病的临床药物［3］。但海南粗榧生长缓慢，对生长环境要求较高［4－7］，加之过度采伐，目前存量稀少，1987年已被列为国家二级重点保护濒危植物。

自然界中微生物与植物存在密切关系，植物内生菌（endophyte）是指在其生活史中的某一段时期生活在健康植物组织内部但不引起植物组织明显侵染及症状改变的一类菌，包括真菌、细菌、卵菌和放线菌［8］。已有研究表明内生菌普遍存在于植物体中［9］，且有可能产生与宿主植物相同或具有相似生理活性的代谢产物［10，11］，因此内生菌作为一类应用前景广阔的资源微生物受到越来越多的关注［12］。

近年来，药用植物内生菌的研究主要集中在活性次生代谢产物上，对真菌的分离主要是通过体外培养法纯化得到。然而有研究表明，即使用多种不同的培养基来培养内生真菌，也无法保证所有生活在植物组织的内生菌全部被分离出来，这是因为有的内生菌不能在人工培养基上生长，无法通过人工培养分离到需要的菌株［13］，而一些与植物自身产生相同活性物质的菌株往往是那些不可离体培养的菌，因此，利用高通量测序技术研究药用植物内生菌群落结构逐渐受到重视。该技术可全面分析植物组织中的菌类，并可通过考察其群落结构多样性及其与周围环境微生物的关系，深入了解药用植物内生菌的来源，有助于进一步丰富人类对药用植物内生菌资源的认识［14］。

本研究采用高通量测序技术对粗榧树皮和叶片中细菌16SrRNA基因及真菌rDNA ITS基因序列进行提取并测序，结合生物信息学对粗榧树皮和叶片中微生物多样性进行分析，为粗榧内生菌资源开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 2019年10月于中国热带农业科学院热带作物品质资源研究所儋州基地（北纬19°50′，东经109°51′）采集的两年实生海南粗榧树皮和叶片样品。

1.1.2 仪器与设备 孚夏超净工作台SWCJ－1G（中国浙江孚夏医疗科技有限公司），QuantiFluorTM－ST荧光计（美国Promega公司），ABI GeneAmp®9700型PCR仪（北京赛百奥科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理 分别称取5 g海南粗榧树皮和叶片样品，用蒸馏水冲洗干净，无菌吸水纸吸干水分，置于灭菌的超净工作台内。先用75%乙醇30 mL表面消毒3 min，然后用无菌水50 mL冲洗3次，再用0.1%升汞30 mL表面消毒5 min，最后用无菌水50 mL冲洗5次，无菌袋保存，寄送上海美吉生物医药科技有限公司测序。

1.2.2 内生菌基因提取 海南粗榧树皮、叶片内生菌总DNA采用D5625－01DNA Kit试剂盒（Omega Biotek Inc.）提取，完成基因组DNA抽提后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测。采用ABI GeneAmp®9700型PCR仪，用TransGen AP221－02高保真DNA聚合酶对细菌16SrRNA基因的V3－V4区进行PCR扩增，引物为338F（5′－ACTCCTACGGGAGGCAGCAG－3′）、806R（5′－GGACTACHVGGGTWTCTAAT－3′）。真菌rDNA ITS区域采用引物ITS 1F（5′－CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA－3′）、2043R（5′－GCTGCGTTCTTCATCGATGC－3′）进行扩增，每个样本3个重复。将同一样本的PCR产物混合后经2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris－HCl洗脱，2%琼脂糖凝胶电泳检测。检测完毕后将PCR产物用QuantiFluorTM－ST蓝色荧光定量系统进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

1.2.3 Miseq文库构建及测序 利用PCR扩增进行文库模板的富集；以氢氧化钠变性，产生单链DNA片段，完成Miseq文库的构建；构建好的文库经定量和检测合格后使用Illumina MiSeq进行上机测序。

1.2.4 生物信息学分析 将测得的原始数据拼接、过滤、校正后得到优化序列。然后在去除嵌合体序列后按照97%相似性对非重复序列进行OTUs（operational taxonomic units）聚类分析。基于OTUs聚类结果，通过Alpha多样性指数Chao1和Shannon［15，16］、Venn图［17］、群落Heatmap图［18］等分析对样品中物种进行注释与评估，以得到样品内物种组成成分、多样性、群落分布结构、丰富度和均匀度等信息。

2 结果与分析

2.1 海南粗榧树皮和叶片内生菌群落多样性和丰富度分析

通过单样品的Alpha多样性分析，可用一系列统计学分析指数反映环境群落的物种丰度和多样性。由图1可以看出，在测序样本数达到15 000条以上时稀释性曲线趋向平稳，表明测序数据量合理时，Alpha多样性分析结果能够代表物种的丰富度。其中，ACE和Chao1指数在生态学中用来估计物种总数，Simpson和Shannon指数用来描述生物的多样性。

图1 海南粗榧树皮和叶片内生菌OTUs稀释性曲线

由表1可知，海南粗榧树皮和叶片样本文库的覆盖率均大于97%，能较好地反映样本真实情况。树皮中细菌的ACE指数、Chao1指数均低于叶片，而真菌的ACE指数、Chao1指数均高于叶片，表明海南粗榧树皮中细菌的丰富度低于叶片，真菌的丰富度则比叶片的高。树皮中细菌的Shannon指数低于叶片，Simpson指数高于叶片，而真菌的两指数与之相反，表明树皮的细菌群落多样性程度比叶片低，真菌群落多样性程度比叶片高。综合分析，海南粗榧树皮中内生菌群落分布与叶片中有所不同，树皮中真菌群落丰富度及多样性均高于叶片，细菌群落丰富度及多样性均低于叶片。

表1 海南粗榧树皮和叶片内生菌群落丰富度和多样性分析

2.2 海南粗榧树皮和叶片内生菌群落相关性分析

Venn图用于统计多个样本中所共有和独有的OTU数目，可直观地表现样本的OTU数目组成相关性及重叠情况。由图2可知，从海南粗榧树皮和叶片中检测到的细菌共有OTUs为135个，特有OTUs分别为31个和49个，分别占树皮和叶片细菌总OTUs的18.67%、26.63%；真菌共有OTUs 44个，特有的分别为235个和124个，分别占树皮和叶片真菌总OTUs的84.23%、73.81%。

图2 海南粗榧树皮和叶片内生菌OTUs的Venn图

2.3 海南粗榧树皮和叶片内生菌群落结构分析

2.3.1 门水平群落结构分析 从图3可以看出，海南粗榧树皮和叶片中内生细菌群落在门水平上主要为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes），其在树皮中的相对丰度分别为44.91%、32.96%、11.98%、6.00%、3.58%，在叶片中的相对丰度分别为55.41%、29.45%、4.37%、4.52%、5.06%。其中，变形菌门（Proteobacteria）为树皮和叶片中的优势菌门，其次是厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）。

图3 海南粗榧树皮和叶片内生菌门水平上的组成与相对丰度

海南粗榧树皮和叶片中内生真菌主要包括子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）及未鉴别的菌门（Fungi_unclassified），其在树皮中的相对丰度分别为91.36%、7.57%、0.72%，在叶片中的相对丰度分别为84.89%、13.01%、1.80%。其中，子囊菌门（Ascomycota）为海南粗榧树皮和叶片中的优势菌门，其次是担子菌门（Basidiomycota）。

上述结果表明，海南粗榧树皮和叶片中内生菌群落门水平的种类相差不大。

2.3.2 属水平群落结构分析 从图4看，海南粗榧树皮中细菌群落在属水平上主要为假单胞菌属（Pseudomonas）、乳球菌属（Lactococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、肠球菌属（Enterococcus）、Cyanobacteria_norank、小单孢菌属（Micromonospora）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）等，其相对丰度均大于2%，其中，假单胞菌属（Pseudomonas）相对丰度最高，是树皮中的优势菌属，占所有菌属的15.73%；粗榧叶片中细菌群落在属水平上主要为假单胞菌属（Pseudomonas）、乳球菌属（Lactococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、肠球菌属（Enterococcus）、Cyanobacteria_norank、不动杆菌属（Acinetobacter）和Moraxellaceae_uncultured等，相对丰度均大于2%，其中，假单胞菌属（Pseudomonas）相对丰度最高，占所有菌属的14.67%，是叶片中的优势菌属。

图4 海南粗榧树皮和叶片内生菌属水平上的组成与相对丰度

粗榧树皮内生真菌群落属水平上主要为杯梗孢属（Cyphellophora）、Ascomycota_unclassified、Nectriaceae_unclassified、Capnodiales_unclassified、帚枝霉属（Sarocladium）、Incertae_sedis_unclassified、德福里斯孢属（Devriesia）、Musicillium、Chaetothyriales_unclassified等，相对丰度均大于2%，其中，杯梗孢属相对丰度最高，是树皮中的优势菌属，占所有菌属的27.06%；粗榧叶片中真菌群落在属水平上主要为Mycosphaerellaceae_unclassified、Sordariomycetes_unclassified、赤霉菌属（Gibberella）、Incertae_sedis_unclassified、链格孢属（Alternaria）、Pleosporales_unclassified、Nectriaceae_unclassified、Ascomycota_unclassified、Capnodiales_unclassified、毛孢子菌属（Trichosporon）、Hannaella等，其相对丰度均大于2%，其中，Mycosphaerellaceae_unclassified相对丰度最高，占所有菌属的17.04%，是叶片中的优势菌属。

上述结果表明海南粗榧树皮和叶片在细菌群落属水平上相差不大，但在真菌群落属水平上存在较大差异。

3 讨论与结论

近年来，高通量测序技术已广泛用于环境、食品及动植物、微生物群落多样性的研究［19］。该技术具有成本低、高通量、效率高的优势，且读取长度较短，不进行全长序列分析，只对一个或几个高变区进行测序分析，可以同时完成传统基因组学研究的测序和注释以及功能基因组学分析，测序深度更加深入，为从分子水平上准确、全面、高效研究微生物群落结构提供了新的研究手段［20］。通过高通量测序技术测定植物内生菌，不仅能获得植物中菌群结构的详细信息，分析植物内部微生态水平与环境关系，为筛选优质菌种发酵生产药物活性成分提供可能，同时还建立了药材道地性鉴别的新模式［21－23］，逐渐成为药用植物微生物资源研究热点。

本研究首次采用高通量测序方法对海南粗榧树皮和叶片内生菌的群落结构与多样性进行了分析，结果表明，内生菌在门水平上主要为变形菌门（Proteobacteria）、子囊菌门（Ascomycota），在属水平上以假单胞菌属（Pseudomonas）和杯梗孢属（Cyphellophora）为主。据研究发现，大多数植物内生菌在门水平上差异不大，细菌以变形菌门、厚壁菌门和放线菌门为主，真菌以子囊菌门和担子菌门为主［24－25］，与本研究结果基本一致，这充分说明植物内生菌在较大分类级别单元中存在相似性。假单胞菌属（Pseudomonas）是对农业生产有益的一类菌，不仅对植物病害有一定防治作用，增加植物本身生长素、赤霉素、细胞分裂素等内源激素的分泌，还可固氮、溶磷，促进植物对养分的吸收，进而改善根系构型，促进植物生长［26－28］。其作为海南粗榧内生优势细菌，对海南粗榧生长可能存在一定的促进作用。本研究还发现，海南粗榧树皮和叶片在真菌群落属水平上存在较大差异，这可能与植物不同组织器官所获光照及营养积累不同有关。叶片光合作用较强，代谢旺盛，能够积累大量营养代谢产物，而树皮代谢差，积累的营养代谢物相对较少。

前人利用传统的划线分离纯化手段鉴定了海南粗榧的内生菌，结果表明其内生真菌主要为刺盘孢属（Colletotrichum）、拟茎点霉（Phomopsis）［29］、根霉属（Rhizopus）和青霉属（Penicillium），而种植于泰国的海南粗榧内生优势真菌为酵母属（Saccharomyces）和毛霉属（Mucor）［30］。传统方法不仅鉴定工作繁琐，工作量大，耗时长，且与高通量测序技术得到的结果存在较大差异，这可能与海南粗榧中某些专性寄生菌不能直接体外培养有关；另外，产地是影响海南粗榧内生菌种类多样性的主要因素。

本研究利用高通量测序技术对海南粗榧树皮和叶片中的微生物多样性进行了全面分析，为后续开展微生物与粗榧细胞组织共培养技术提供了参考，这也是后续研究将面临的新挑战。