莠去津对谷子农田土壤微生物群落结构的影响

黄潇 蔡颖慧 赵小珍

摘要：以山西省太原市阳曲县谷子种植区土壤为研究对象，运用IlluminaHiSeq高通量测序技术，分析莠去津胁迫下土壤微生物群落结构变化。由α多样性指数分析可知，莠去津降低了土壤微生物的丰富度和群落多样性，喷洒浓度越高，丰度和多样性越低;在黄土高原谷子种植区，土壤真菌主要门类为子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）;土壤细菌主要门类为变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门 （Gemmatimonadetes） 、拟杆菌门（Bacteroidetes）。从门、纲水平上进行分析，高浓度莠去津污染土壤样品和低浓度莠去津污染土壤样品中的优势真菌和细菌种类基本相同。

关键词：莠去津;谷子农田;土壤微生物;高通量测序;真菌;细菌

中图分类号： X53 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2021）16-0210-04

莠去津别称阿特拉津，是一种内吸选择性除草剂，可以有效防除多种一年生禾本科和阔叶杂草，杀草谱广，在世界范围内被广泛应用于谷类作物生产中。但残留于土壤中的莠去津会影响后茬作物生长，污染农田土壤，造成地下水污染，导致土地“癌化”，还会给土壤微生物带来不可估量的破坏。土壤微生物参与土壤碳、氮等元素的循环，发挥着有机质分解、养分转化、有害物质降解等重要作用，可通过硝化、固氮、土壤酶释放、生物降解等生化过程来改善土壤生态系统，土壤微生物是影响土壤质量的重要因素之一。研究除草剂施用后土壤中微生物的群落组成结构，对于改善土壤结构具有重要的理论指导意义[1-4]。

本研究对山西省谷子主产区之一——阳曲县的土壤样品进行土壤理化性质分析，并通过IlluminaHiSeq高通量测序，分析其微生物群落组成及多样性，比较不同程度莠去津干预下土壤微生物的群落结构差异，对于了解莠去津对土壤微生物群落的影响及土壤微生物恢复，为建立谷子产区莠去津污染检测的生物指标奠定理论及试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验地点位于山西省太原市阳曲县定点试验田（112°32′15.35″E、38°05′18.06″N）。试验地地势平坦，境内属暖温带大陆性季风气候，年平均气温 6～9 ℃，年平均降水量为441.2 mm，无霜期为 164 d 左右。试验区的土壤类型为山西黄土，供试作物为谷子。

1.2 试验设计与取样

1.2.1 试验设计 采用38%莠去津水悬浮剂，试验时间为2017年6月上旬至7月上旬，对谷子幼苗3～4叶期进行喷雾处理。根据相关文献报道的莠去津的处理剂量和正常使用情况下土壤中莠去津的浓度[5-6]，药剂用量设计为4个处理，即：0、2、5、8 L/hm2。

1.2.2 土壤取样 2019年9月份，采用五点法取样采集2～20 cm表层土样。过2 mm筛子，去除杂草、碎石等杂质，4 ℃保存待用。部分土样自然风干，用于土壤基本理化性质测定。测定方法参照国际中的测定方法，每个样品做3个平行测定[7]。供试土壤样品的理化性质见表1。

1.2.3 土壤样品PCR 采用生工生物工程（上海）股份有限公司的基因组DNA快速抽提试剂盒进行土壤样品DNA的提取。称取0.5 g保存于 4 ℃ 冰箱中的土壤样品，按试剂盒说明书过程提取土壤样品总DNA;將提取得到的DNA溶解于50～100 μL TE Buffer中，20 ℃保存。

细菌扩增：选择16S rDNA V4区域扩增通用引物，以5～50 ng DNA 为模板，PCR 扩增细菌DNA片断[8];真菌扩增：选择ITS2 可变区扩增通用引物，以5～50 ng DNA 为模板，PCR 扩增真菌 ITS rDNA[9]。

1.2.4 高通量测序 采用2%浓度的琼脂糖凝胶对土壤样品PCR产物进行电泳检测，利用胶回收试剂盒回收产物。构建真菌ITS rDNA、细菌16S rDNA V4区域文库，Qubit 和实时定量 PCR检测合格后，通过Illumina MiSeq上机测序[9-10]。

1.3 数据分析

对测得的土壤样品的所有序列进行聚类、分析，按照97%的相似度将获得序列聚类成同一分类操作单元OTUs，通常每一个 OTU被视为一个微生物物种。将OTUs与ITS rDNA、16S rDNA片断进行比对，并对OTUs 的代表序列进行物种注释分析，确定扩增序列对应的微生物，并分析不同物种分类水平下各样本的群落组成。根据 OTU 分析结果，对样本序列进行随机抽样，采用Qiime 1.9.1计算土壤微生物α多样性指数[11-12]。

2 结果与分析

2.1 不同浓度莠去津下土壤微生物群落组成

土壤微生物高通量测序结果（表2）显示，从4个土壤样品中共检测到325 182个真菌原始序列数，属于子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）5个菌门;共检测到441 513个细菌原始序列数，属于变形菌门（Proteobacteria） 、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes） 、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi） 、厚壁菌门（Firmicutes）、浮霉菌门（Planctomycetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）这9个菌门。依据97%的相似度划分为真菌OUTs数为393～489，细菌OUTs数为593～705。

2.2 不同莠去津干扰下土壤微生物多样性分析

多样性指数是用来测定物种丰富度和均匀度的综合指标，主要有3个空间尺度：Alpha（α）多样性、β多样性、γ多样性。其中α多样性，重点关注均匀生境下的物种数目，通过单样本的多样性分析反映样品内微生物群落的丰富度和多样性。通常有测序深度指数（Observed spieces 和Goods coverage）、菌群丰度（Chao1和ACE）和菌群多样性指数（Shannon和Simpson）。Goods-coverage指数数值越高，表示样品被测出的概率越高;Chao1或ACE指数越大，表示群落丰富度越高;Shannon指数越大，表示群落多样性越高[13-14]。

由表3可知，对照土壤中真菌与细菌ACE指数和Chao1指数均为最高，说明没有喷洒莠去津的土壤样品中，物种丰度最高;对照土壤中Shannon指数最高，说明土壤群落多样性最高;而在莠去津喷洒浓度为8 L/hm2情况下，ACE指数、Chao1指数和Shannon指数均为最低，说明在此喷洒浓度下，土壤微生物群落丰富度和多样性均最低。

2.3 不同浓度莠去津下土壤微生物群落组成

不同浓度莠去津胁迫条件下，土壤微生物优势物种的相对丰度如图1、图2所示。土壤真菌主要门类为子囊菌门、接合菌门、担子菌门、壶菌门、球囊菌门，在4个土壤样品中这5个门的相对丰度可分别占平均值的61.9%、12.5%、6.8%、1.9%和0.9%，另外，未明确分类真菌（Unidentified）也占有较高比例（16.2%）。土壤中细菌优势菌群为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门，分别平均占比30.38%、15.76%、12.69%、8.29%、6.12%，其相对丰度之和可以占到73.24%，相对丰度超过2%的还有厚壁菌门 （3.92%）、绿弯菌门（3.59%）、浮霉菌门（2.17%）、疣微菌门（2.0%）。

由图1、图2可以看出，喷洒不同浓度莠去津土壤中微生物优势门类相对丰度有一定的差异。真菌类群中，接合菌门在4种土壤样品中的相对丰度变化不大;担子菌门和球囊菌门的相对丰度在对照土壤中高于其他3种喷洒过莠去津的土壤。对照土壤以及喷洒浓度为2 L/hm2的土壤中子囊菌门相对丰度大于莠去津喷洒浓度为5、8 L/hm2的土壤;在细菌类群中，变形菌门在4种土壤样品中的相对丰度变化不大;其他门类细菌在对照土壤中相对丰度均大于喷洒莠去津的土壤。未喷洒过莠去津的对照土壤中微生物多样性更为丰富。

进一步考察样品中土壤微生物在纲水平下的优势相对丰度。如图3所示，4种土壤样品中真菌纲水平的优势物种主要有伞菌纲（Agaricomycetes，23.03%） 、粪壳菌纲（Sordariomycetes，16.38%）、散囊菌纲（Eurotiomycetes，2.59%）、座囊菌纲（Dothideomycetes，4.69%）、未明确分类真菌（Unidentified，15.56%）、锤舌菌纲（Leotiomycetes，3.97%） 、丝孢纲（ Hyphomycetes，1.64%）、球囊菌纲 （Glomeromycetes，0.32%）、其他 （Others，31.82%）。

如图4所示，4种土壤样品中细菌的优势菌纲为γ-变形菌纲（γ-Proteobacteria，12.29%）、α-变形菌纲（α-Proteobacteria，10.87%）、β-变形菌纲（β-Proteobacteria，9.67%）、酸杆菌纲（Acidobacteria，11.34%）、放线杆菌纲（Actinobacteria，10.69%）、芽单胞杆菌纲（Gemmatimonadetes，7.45%）、酸微菌纲（Acidimicrobiia，5.71%）、硝化螺菌纲（Nitrospira，2.58%）、浮霉菌纲（Planctomycetacia，2.03%）。同时，γ-变形菌纲、α-变形菌纲、β-变形菌纲、酸杆菌纲、放线菌纲为优势菌纲，其相对丰度之和可以占到总数的54.86%。

土壤样品中，伞菌纲的相对丰度最高，可占到所有真菌纲的18.6%～27.7%，粪壳菌纲的相对丰度可以占到所有真菌纲的14.7%～19.1%。细菌中，变形菌纲的相对丰度最高，可占到所有细菌纲的30%以上。对照土壤和莠去津浓度为2 L/hm2的土壤样品中，优势菌纲的相对丰度变化不大，但均大于5、8 L/hm2的土壤中优势菌纲的相对丰度。未喷洒莠去津的对照土壤中微生物多样性更为丰富。

3 结论与讨论

土壤微生物参与土壤碳、氮等元素的循环及养分的转化过程，可以调控土壤碳截获能力和有机碳矿化过程，影响生态系统生产力，在一定程度上可以直接反映土壤肥力的高低[15]，同时土壤微生物比较敏感，易受到外界环境条件的影响。土壤类型、含水量、有机碳和总氮含量等理化性质以及作物种类、种植制度、土壤类型、水肥管理等农业管理措施都会影响土壤微生物群落结构[16-18]。在本研究中，以山西省黄土高原谷子种植区土壤为研究对象，考察不同浓度莠去津干预下土壤真菌和细菌菌群结构变化情况。由于受其他人为干扰因素较少，4种类型的土壤样品理化性质差异不显著，莠去津为影响土壤微生物群落结构的主要因素。

研究结果表明，未喷洒过莠去津的对照土壤中微生物多样性更为丰富。从门、纲水平上对黄土高原谷子种植区土壤真菌和细菌群落进行分析，结果表明不同浓度莠去津胁迫下土壤样品中的优势真菌种类基本相同，但优势真菌的相对丰度不同。谷子种植区土壤真菌的优势门类为子囊菌门、接合菌门、担子菌门、壶菌门、球囊菌门，优势纲类为伞菌纲、粪壳菌纲;细菌的优势门類为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门，优势纲类为 γ-变形菌纲、α-变形菌纲、β-变形菌纲、酸杆菌纲、放线菌纲，这与绝大多数土壤细菌的优势细菌种类基本相同[18-19]。

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