猪源丁酸梭菌DSY-1产芽孢高密度发酵条件优化

杜全能 区毅恒 余杰豪 刘子恒 史宝军

摘要：为获取丁酸梭菌芽孢高密度发酵工艺，以丁酸梭菌DSY-1为试验材料，以芽孢数为指标，通过单因素试验，探究碳源、氮源、接种量、初始pH值、培养温度和正交试验，并通过5 L发酵罐进行中和剂选择。结果表明，菌株DSY-1以C6H12O6 30 g/L、酵母提取粉10 g/L、NaCl 5 g/L、乙酸钠 5 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、L-半胱氨酸酸盐 0.5 g/L为发酵培养基，初始pH值为6.5，培养温度为35 ℃，接种量为2.5%，5 L发酵灌发酵使用12.5%氨水作中和剂时，菌株 DSY-1 芽孢数最大，达9.3亿CFU/mL。

关键词：丁酸梭菌;正交试验;芽孢生物量;发酵工艺

中图分类号：S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2021）16-0148-05

随着我国养殖业的发展，养殖模式已经转向集约化、规模化发展。为了减少病害，人们在饲料中添加抗生素，虽起到了促进动物生长的作用，但也造成了抗生素的滥用。我国每年约8 000 t的抗生素被用于动物疾病预防和治疗[1]。在禁抗大背景下，禁抗替抗已成为养殖行业持续健康发展和食品安全的重点话题。近年来，益生菌作为替抗产品，乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等已被广泛应用于养殖业中[2-3]。

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）属于梭菌科梭菌属，为革兰氏阳性厌氧杆菌，具有耐胃酸、耐胆盐特性。自1933年，日本Miyairy博士首次从粪便中分离出丁酸梭菌便引起了科学家广泛关注。目前，丁酸梭菌被广泛应用于养殖行业中。研究发现，在基础日粮中添加丁酸梭菌能够增强机体的免疫力、提高抗氧化性能[3-4]、改善肉品质[5-6]和肠道组织形态[7-11]、抑制肠道中有害菌群、提高有益菌群丰度[11-12]。

目前，制约丁酸梭菌微生态制剂大规模生产的主要因素是制备过程中菌体量和芽孢量过低。本试验采用单因素试验和正交试验优化发酵培养基和5 L发酵罐培养优化，探究对丁酸梭菌芽孢产量的影响，为丁酸梭菌芽孢的高密度发酵提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 丁酸梭菌DSY-1由笔者所在实验室筛选获得。

1.1.2 培养基 种子液：蛋白胨10 g/L、牛肉膏 10 g/L、葡萄糖5 g/L、氯化钠 5 g/L、可溶性淀粉 1 g/L、乙酸钠3 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L。pH值7.0±0.1，121 ℃灭菌20 min。

LB液体培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉 5 g/L、NaCl 10 g/L。固體培养基加20 g/L琼脂。121 ℃灭菌20 min。

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉5 g/L、NaCl 10 g/L、20 g/L琼脂。121 ℃灭菌20 min。

活化培养基：同种子液，加20 g/L琼脂。pH值 7.0±0.1，121 ℃灭菌20 min。

芽孢计数培养基：下层为TSC培养基+5 g/L琼脂，上层：18 g/L海藻酸钠+30 g/L TSC培养基。121 ℃灭菌20 min。

基础发酵培养基：C6H12O6 30 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、乙酸钠 5 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、L-半胱氨酸酸盐 0.5 g/L，pH值6.4±0.1，115 ℃灭菌20 min。

1.1.3 试验药品 蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、可溶性淀粉、琼脂（BR），广东环凯生物科技有限公司生产;K2HPO4、MgSO4·7H2O、C6H12O6、NaCl、乙酸钠、L-半胱氨酸盐酸盐、海藻酸钠（AR），国药集团化学试剂有限公司生产;TSC培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司生产。

1.1.4 试验仪器 雷磁pH计（pH-3C），上海仪电科学仪器股份有限公司生产;厌氧袋（C-11），日本三菱公司生产;鼓风干燥箱（DHG-9246A），上海精宏实验设备有限公司生产;恒温培养箱（DNP-9052），上海精宏实验设备有限公司生产;高压灭菌锅（YXQ-LS-100S），上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产;显微镜（CX-23），日本奥林巴斯;电子天平（ME204E），梅特勒-托利多仪器有限公司生产;超净工作台（SW-CJ-ID），苏州净化设备有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化及种子液制备 吸取于-80 ℃甘油管保藏的菌种DSY-1 1 mL，接种于液体种子液中，并置于厌氧培养箱中37 ℃培养24 h。

1.2.2 发酵培养 将培养24 h的种子液按3 ∶ 100（体积比）接种于装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，置于37 ℃厌氧培养箱中培养48 h。

1.2.3 芽孢计数 芽孢计数方法与李雯静等的方法[13]相同。

1.2.4 不同因素对菌株DS-1芽孢产量的影响 为了探究菌株DSY-1最佳碳源，选取淀粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖来替换基础发酵培养基中的葡萄糖，添加量均为1%;在最佳氮源选择试验中，选取牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵来替换基础发酵培养基中的氮源，添加量均为3%;为了研究接种量对菌株 DSY-1 芽孢产量的影响，分别以体积分数为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3%的接种量将种子液接入发酵培养基中;为了探究初始pH值对菌株芽孢产量的影响，利用3 mol/L HCl或3 mol/L NaOH调节培养基中的pH值至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5;上述试验接种量均为2.5%，置于37 ℃恒温培养箱中培养48 h。在上述试验的基础上，探究不同培养温度对菌株DSY-1生长的影响，将发酵培养基置于25、30、35、40、45 ℃恒温培养箱中培养。以上所有试验均进行3次重复。

1.2.5 正交试验 在单因素试验结果的基础上，采用正交试验优化菌株DSY-1产芽孢最佳条件。本试验选取初始pH值（A）、培养温度（B）、接种量（C）3个对菌株产芽孢影响较大的因素，对其进行3因素3水平试验，以确定上述3因素对菌株DSY-1产芽孢最佳组合，其正交试验设计见表1。

1.2.6 5 L发酵罐发酵试验 在“1.2.5”节试验结果的基础上配制培养基，装液量70%，接种量3%，转速50 r/min，培养温度为35 ℃，培养时间为48 h。发酵过程不控制pH值自然发酵;发酵过程中前 24 h，用12.5%氨水将pH值维持在6.5±0.2。

1.2.7 不同中和剂对菌株DSY-1芽孢产量的影响 在上述单因素试验和正交试验结果的基础上，以12.5%、25.0%、50.0%氨水，3 mol/L NaOH、3 mol/L Ca（OH）2、3 mol/L KOH调节pH值。

1.2.8 数据分析 使用Excel统计数据，采用统计软件SPSS 25中的One-Way ANOVA进行单因素方差分析，用Turkey多重比较法对处理间的差异性进行比较分析，结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05为差异显著。采用GraphPad Prism 8.0.1作图。

2 结果与分析

2.1 菌株DSY-1菌落形态与菌体形态

菌株DSY-1在计数平板上的菌落形态见图1，菌落表面光滑、不透明，呈黑色。菌体形态见图2，为革兰氏阳性菌，有芽孢产生，菌体成杆状。

2.2 不同碳源对菌株DSY-1产芽孢的影响

碳源作为细胞合成的骨架和能量来源，在细胞生长过程中起着重要的作用。从图3中可以看出，麦芽糖和乳糖对菌株产芽孢不存在显著性差异（P>0.05），其余碳源对菌株DSY-1产芽孢存在显著性差异（P<0.05）。其中，淀粉、乳糖、蔗糖和麦芽糖4种碳源属于多糖和双糖，菌株 DSY-1 对其利用均低于葡萄糖。在以葡萄糖为唯一碳源时，菌株 DSY-1 芽孢产量最大，可达（2.40±0.10）亿CFU/mL，因此采用葡萄糖作为唯一碳源进行后续试验。

2.3 不同氮源对菌株DSY-1芽孢产量的影响

氮是构成微生物细胞的蛋白质及核酸的主要物质。从图4可以看出，5种氮源对菌株DSY-1芽孢产量存在显著影响（P<0.05）。5种氮源中芽孢产量从大到小表现为酵母提取粉>蛋白胨>牛肉膏>尿素>硫酸铵，可能是由于丁酸梭菌生长需要的营养比较复杂，而无机氮无法提供。酵母提取粉为唯一氮源时，菌株芽孢数最大，达（3.47±0.25）亿CFU/mL。

2.4 接种量对菌株DSY-1芽孢产量的影响

接种量可以影响菌体增殖的速度，适当的接种量能够缩短菌体的延滞期。从图5可以看出，随着接种量的增加，菌株DSY-1芽孢产量呈先上升后下降的趋势，在接种量为3%时，芽孢产量达到最大。接种量低，引起菌株延滞期过长;而当接种量超过3%时，或许由于菌体生长过快，培养基中pH值下降，造成酸胁迫效应;在接种量为3%时，菌株DSY-1获得的芽孢最多，为（4.47±0.04）亿CFU/mL。

2.5 不同初始pH值对菌株DSY-1芽孢产量的影响

由图6可知，在初始pH值5.5～7.5之间，菌株芽孢产量存在显著差异（P<0.05）;而在初始pH值6.0～6.5之间，菌株DSY-1芽孢产量不存在显著差异（P>0.05）。可见，菌株DSY-1适合在弱酸性条件下生长，且菌株DSY-1在初始pH值6.5时具有最大芽孢产量，为（4.47±0.18）亿CFU/mL。

2.6 不同培养温度对菌株DSY-1芽孢产量的影响

培养温度对菌株DSY-1芽孢产量存在显著性影响（P<0.05），从图7可以看出，随着培养温度升高 菌株芽孢产量呈先上升后下降的趋势。培养温度过低或过高可能影响菌株DSY-1代谢活动，进而影响菌体的生长;在温度为35 ℃时，菌株芽孢产量达到最大，为（5.82±0.10）亿CFU/mL。

2.7 正交试验结果

从表2可以看出，以芽孢产量为指标，通过正交试验发现，影响菌株DSY-1芽孢产量因素表现为培养温度>初始pH值>接种量，最优组合为A2B2C3，即发酵培养基初始pH值为6.5，培养温度为35 ℃，接种量为2.5%时，菌株DSY-1具有最大芽孢产量。

2.8 自然发酵与控pH值发酵

从表3可以看出，用50%氨水控制pH值6.5发酵芽孢数是自然发酵的1.7倍，可見酸胁迫严重抑制菌株DSY-1的生长，而通过控制发酵pH值可大幅度提高芽孢产量。

2.9 不同中和剂对菌株DSY-1芽孢产量的影响

从图8可以看出，不同中和剂对菌株DSY-1产芽孢存在显著性影响（P<0 .05）。以12.5%氨水为中和剂时，菌株DSY-1具有最大的芽孢产量。而当氨水为25%和50%时，芽孢产量均低于12.5%氨水，可能是由于氨浓度过高不能及时中和，导致发酵液中游离氨浓度升高，进而抑制菌体生长。当以NaOH和Ca（OH）2、KOH作为中和剂时，效果均低于氨水。可能是由于盐离子影响细胞内外渗透压，不利于菌体的生长。因此，选用12.5%氨水作为中和剂进行控pH值。

3 讨论与结论

本次碳源试验结果发现，以葡萄糖作为唯一碳源时，菌株DSY-1具有最佳芽孢产量，这与徐莹等研究结果[14-16]一致。也有研究者发现，可溶性淀粉[17]、麦芽糖[18]作为唯一碳源时，丁酸梭菌具有最大的芽孢产量。李雯静等认为，面粉和米粉作为混合碳源时，可获得最大的芽孢产量。可见，不同菌株对于碳源的利用情况有所差异[13]。

菌株DSY-1在以酵母提取粉为唯一氮源时，具有最大的芽孢产量，这与邢宏观等的研究结果[17]一致。而徐莹等认为，以胰蛋白胨为唯一氮源时具有最大的芽孢产量[14]。而菌株HDRyYB1[13]以鱼粉、酵母粉作为混合氮源时，具有最大的芽孢产量。史祯晖研究发现，菌株SHYY088以酵母自溶粉和酵母浸膏作为混合氮源时，具有最大的芽孢产量[18]。接种量过高或过低均影响菌株的生长，接种量过大使得代谢产物积累过快，造成酸胁迫;而过小则引起延滞期过长，本试验结果与胡晓龙等结论[19]相似。

初始pH值和培养温度是制约丁酸梭菌高密度生长的重要因素，过低或过高的初始pH值会改变细胞膜的通透性，进而影响菌体的生长和代谢;而培养温度则影响生物体重酶的活性，从而造成菌体代谢缓慢。有研究认为，初始pH值在7.2～7.4[13]、7.3[16]时，菌株具有最大的芽孢产量。赵旭冬研究发现，通过补碱使pH值维持在6.8，所得芽孢数高于自然发酵[15]。史祯晖认为，pH值6.5更适合菌株生长[18]。而Li等发现，在初始pH值 6.0～7.5对丁酸梭菌NN-2活菌数和产芽孢数均无显著性影响（P>0.05）[20]。本试验结果与赵旭冬研究结论[15]相一致，在pH值为6.8时能够获得最多芽孢。本试验发现，菌株DSY-1在35 ℃下，产芽孢量达到最大。相关研究发现，丁酸梭菌在 32 ℃[18]、37 ℃[16]具有最大芽孢产量。

在发酵过程中调控pH值有利于缓解酸胁迫，利于菌体的生长。众多研究发现，在发酵过程中通过调控pH值有利于菌体的生长[14-15，21]，这与本试验结果相一致。

通过单因素试验和正交试验确定碳源、氮源、培养条件对丁酸梭菌DSY-1产芽孢的影响。在以葡萄糖和酵母提取粉分别作为唯一碳源和氮源，培养温度为35 ℃、初始pH值为6.5，接种量为2.5%时，菌株DSY-1具有最大的芽孢产量。在5 L发酵试验中，通过使用12.5%氨水在发酵前 24 h使pH值维持在6.5，使得芽孢数是自然发酵的1.7倍，最终芽孢产量为（9.30±0.09）亿CFU/mL。

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