酶法辅助提取藜麦秸秆蛋白工艺研究

商海军 蒋丽君 於春 江本利 姚晓华 闫晓明

摘要 [目的] 优化生物酶辅助提取藜麦秸秆蛋白的工艺。[方法]分别探讨纤维素酶和果胶酶的添加量、提取温度和时间对藜麦秸秆蛋白提取的影响，并选取提取率较高的酶进行正交试验优化工艺。[结果]纤维素酶提取藜麦蛋白的效果优于果胶酶，通过正交试验结果得到提取温度对藜麦秸秆蛋白提取影响最大，加酶量次之，提取时间影响最小，确定了最优工艺：纤维素酶的添加量275 U/g，提取温度50 ℃，提取时间8 h，此时最佳提取率为40.68%。[结论]该提取方法安全无污染，提取率高，是提取藜麦秸秆蛋白简单有效的办法，使藜麦副产物的资源得到充分利用。

关键词 藜麦秸秆;蛋白质;生物酶;提取;正交试验

中图分类号 TS201.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）17-0170-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.045

Abstract [Objective] To optimize the extraction process of quinoa straw protein assisted by biological enzymes. [Method] The effects of cellulase and pectinase addition， extraction temperature and time on the extraction of quinoa straw protein were investigated， and the enzyme with higher extraction rate was selected to optimize the process by orthogonal experiment. [Result] The effect of cellulase in extracting quinoa protein was better than pectinase. According to the results of orthogonal test， the extraction temperature had the greatest effect on the extraction of quinoa straw protein， followed by the amount of enzyme， and the extraction time had the least effect. The optimum technological conditions were determined： the amount of cellulase added was 275 U/g， the extraction temperature was 50 °C， and the extraction time was 8 h. At this time， the best extraction rate was 40.68%. [Conclusion] The extraction method was safe and pollution-free， with high extraction rate. It is a simple and effective method for extracting quinoa straw protein， so that the resources of quinoa by-products can be fully utilized.

Key words Quinoa straw;Protein;Biological enzyme;Extraction;Orthogonal test

藜麥是苋科一种双子叶植物[1]，来源安第斯山脉等高海拔地区，栽培7 000年左右[2]。藜麦含有许多营养物质，如蛋白质、维生素、矿物质、脂肪酸和纤维素等[3]，研究表明，藜麦不仅富含营养成分，还含有多酚、皂苷、黄酮等生物活性物质，具有很强的抗氧化能力[4-5]，NASA称它为营养全面的食品，是一种理想的“太空粮食”[6]，2013年也被设定为国际藜麦年，以此来促进藜麦在世界上的推广。近年来已在我国青海、新疆、山西和宁夏开始种植[7]。

目前，对于藜麦的研究主要是籽实部位，但作为藜麦植株一部分的藜麦秸秆在藜麦收割时被遗弃。大量的藜麦秸秆腐烂在田间，虽然可以肥沃土地，但其营养价值未能充分利用。藜麦秸秆含有大量的蛋白质，含量在11%～13%，高于水稻，与大麦和玉米相当，是一种很好的植物蛋白来源。目前，蛋白提取的方法主要包括碱溶酸沉法[8]、生物酶法[9]、盐溶法[10]、有机溶剂法[11]等。传统的提取方法存在很多不足，碱溶酸沉法工艺简单，成本低，但容易造成环境污染，且提取的蛋白容易含有有毒物质;盐溶法耗盐量大，生产成本高，不适宜工厂化生产;有机溶剂法对含硫氨基酸破坏性较大，蛋白质品质差，且易造成有机试剂残留。而生物酶法提取植物蛋白质，作用条件温和，对蛋白质品质无影响，营养物质基本不遭到破坏。

因此，笔者通过使用纤维素酶和果胶酶2种不同的生物酶分别对藜麦秸秆进行蛋白提取，以蛋白质提取率来评价提取效果，然后通过正交试验，得到藜麦秸秆的最佳提取工艺。通过对藜麦秸秆蛋白的提取，不仅能够拓宽植物蛋白质的来源，还可以解决藜麦收割后大量秸秆的利用问题，对开发并利用藜麦秸秆具有研究价值与意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藜麦秸秆，青海省农业科学院种植基地提供;试验所用化学试剂均为分析纯，购于合肥拜尔迪生物科技有限公司。

1.2 主要仪器

DHG-9143135-11电热鼓风干燥箱，购自上海新苗医疗器械制造公司;VELP-UDK159全自动凯氏定氮仪，购自北京金洋万达科技有限公司;JYL-C19V型九阳电动料理机，购自九阳股份有限公司;DK-S26型电热恒温水浴锅，购自上海精宏实验设备有限公司;YP30001电子天平，购自上海衡际科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

称取150 g藜麦秸秆，向其中加入450 mL蒸馏水，打浆1 min后超声处理30 min，超声处理使秸秆的细胞壁打开，促进蛋白质的溶解[12]。将浆液过100目筛，收集处理的浆液，然后向浆液中加HCl调节pH至5.0，再向其中加入一定量的酶，置于水浴锅中于一定温度条件下酶解一定时间后取出进行灭酶，灭酶结束后，置于离心机中5 000 r/min离心20 min，离心结束后收集沉淀物并在真空冷冻干燥机中干燥24 h，取出后磨粉，最后得藜麦秸秆粗蛋白粉，干燥处保存备用。藜麦秸秆蛋白的含量采用常量凯氏定氮法进行测定，藜麦秸秆蛋白提取率的计算公式[13]：

式中，w为蛋白质提取率，%;m1为提取的蛋白质干粉质量，g;C1为粗蛋白占提取蛋白质干粉质量百分比，%;m2为原料质量，g;C2为原料中干物质的百分含量，%;C3为原料中粗蛋白占干物质的百分含量，%，即提取出的蛋白质干燥后的质量占原料蛋白质的质量百分比。

1.4 纤维素酶提取藜麦秸秆蛋白的单因素试验

1.4.1 提取温度对藜麦秸秆蛋白提取率的影响。

称取150 g藜麦秸秆，向其中加入450 mL蒸馏水，打浆1 min后超声处理30 min，将浆液过100目筛，向浆液中加HCl调节pH至5.0，加入250 U/g纤维素酶，置于水浴锅中分别于40、45、50、55、60 ℃温度条件下酶解8 h，后面操作同“1.3”试验方法中的条件处理。

1.4.2 提取时间对藜麦秸秆蛋白提取率的影响。

称取150 g藜麦秸秆，向其中加入450 mL蒸馏水，打浆1 min后超声处理30 min，将浆液过100目筛，向浆液中加HCl调节pH至5.0，加入250 U/g纤维素酶，在50 ℃水浴锅中分别酶解4、6、8、10、12 h，后面操作同“1.3”试验方法中的条件处理。

1.4.3 加酶量对藜麦秸秆蛋白提取率的影响。

称取150 g藜麦秸秆，向其中加入450 mL蒸馏水，打浆1 min后超声处理30 min，将浆液过100目筛，向浆液中加HCl调节pH至5.0，分别向其中加入100、150、200、250、300 U/g纤维素酶，在50 ℃水浴锅中酶解8 h，后面操作同“1.3”试验方法中的条件处理。

1.5 果胶酶提取藜麦秸秆蛋白的单因素试验

1.5.1 提取温度对藜麦秸秆蛋白提取率的影响。

称取150 g藜麦秸秆，向其中加入450 mL蒸馏水，打浆1 min后超声处理30 min，将浆液过100目筛，向浆液中加HCl调节pH至5.0，加入250 U/g果胶酶，置于水浴锅中分别于40、45、50、55、60 ℃温度条件下酶解8 h，后面操作同“1.3”试验方法中的条件处理。

1.5.2 提取时间对藜麦秸秆蛋白提取率的影响。

称取150 g藜麦秸秆，向其中加入450 mL蒸馏水，打浆1 min后超声处理30 min，将浆液过100目筛，向浆液中加HCl调节pH至5.0，加入250 U/g果胶酶，在50 ℃水浴锅中分别酶解4、6、8、10、12 h，后面操作同“1.3”试验方法中的条件处理。

1.5.3 加酶量对藜麦秸秆蛋白提取率的影响。

称取150 g藜麦秸秆，向其中加入450 mL蒸馏水，打浆1 min后超声处理30 min，将浆液过100目筛，向浆液中加HCl调节pH至5.0，分别向其中加入100、150、200、250、300 U/g果胶酶，在50 ℃水浴锅中酶解8 h，后面操作同“1.3”试验方法中的条件处理。

1.6 最佳提取工艺的正交优化

为了确定藜麦秸秆蛋白提取的最佳工艺，通过2种酶提取藜麦秸秆蛋白的试验结果，选出藜麦秸秆蛋白提取率较高的纤维素酶进行工艺优化，选取提取的温度、时间以及加酶量3个对象为考察因素，以藜麦秸秆蛋白的提取率为指标，采用L9（33）正交优化试验，正交试验设计见表1。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶提取藜麦秸秆蛋白的单因素试验

2.1.1 温度对藜麦秸秆蛋白提取率的影响。

从图1可以看出，温度在40～50 ℃时，藜麦秸秆蛋白提取率明显增加。温度在50 ℃时，蛋白的提取率上升到最高，为37.79%，但随着温度的继续升高，蛋白提取率渐渐平缓且略有下降。这是因为初始温度适中，有助于分子扩散，蛋白质溶出速度加快，进而提取率升高，但随着温度的升高，酶活力降低，且蛋白质的构象会改变，导致变性，所以蛋白提取率渐渐下降[14]。因此温度不能太高，综合考虑，温度选择50 ℃为宜。

2.1.2 时间对藜麦秸秆蛋白提取率的影响。

从图2可以看出，酶解时间在4～8 h时，随着时间的增加，藜麦秸秆蛋白的提取率显著增高。当提取时间为10 h时，提取率达到最高，为37.83%，随着反应时间的继续增加，藜麦秸秆蛋白的提取率逐渐平缓且略有下降。这是因为酶解反应刚开始时，细胞壁裂解不完全，蛋白溶出速度慢，随着酶解时间的增加，再加上底物的濃度较高，酶解反应速度加快，从而蛋白质的提取率不断增加，随着酶解时间的继续增加，酶将降解一些蛋白质，蛋白质也因此损失，底物浓度下降，导致蛋白质提取率趋于平缓且略有下降[15-16]。因此，酶解时间不能过长，根据试验结果，综合考虑，选择8 h为宜。

2.1.3 加酶量对藜麦秸秆蛋白提取率的影响。

从图3可以看出，加酶量在100～250 U/g时，随着加酶量的增加，蛋白质的提取率上升较快。这是因为细胞壁被纤维素酶不断裂解，蛋白质暴露出来逐渐变多，藜麦秸秆蛋白的溶出率也因此增加[15]，所以蛋白提取率不断升高。当加酶量为300 U/g时，提取率最高，达37.88%。加酶量在250～300 U/g时，蛋白质的提取率趋于平缓，原因是酶的添加量过多，一些蛋白质会被降解，导致蛋白质的提取率下降。综合考虑提取率及提取成本等问题，选择加酶量250 U/g为宜。

2.2 果胶酶提取藜麦秸秆蛋白的单因素试验

2.2.1 温度对藜麦秸秆蛋白提取率的影响。

从图4可以看出，温度在35～45 ℃时，藜麦秸秆蛋白的提取率呈明显增加趋势。温度达50 ℃时，蛋白提取率上升到最高，为31.77%，但随着温度的继续升高，蛋白质提取率趋于平缓且略有下降。这是因为初始温度适中，分子反应活跃，酶与底物结合概率增大，进而提取率升高，随着温度的升高，酶发生变性，酶活力降低，酶解反应渐渐减少，导致蛋白提取率下降[17]。因此温度不能太高，综合考虑，温度选择50 ℃为宜。

2.2.2 时间对藜麦秸秆蛋白提取率的影响。

从图5可以看出，酶解时间在4～8 h时，藜麦秸秆蛋白的提取率升高速度很快。当提取时间为10 h时，提取率达到最高，为31.85%，随着提取时间继续增加，蛋白质提取率趋于平缓且略有下降。这是因为酶解反应刚开始时，属于过量底物存在下的零级反应期，酶解反应速度加快，从而蛋白质的提取率不断增加，随着反应的继续进行，底物浓度下降，产物浓度上升，导致藜麦秸秆蛋白质提取变慢。因此，酶解时间不能过长，综合考虑，选择8 h为宜。

2.2.3 加酶量对藜麦秸秆蛋白提取率的影响。

从图6可以看出，加酶量在100～300 U/g时，随着加酶量的增加，蛋白质的提取率不断提高。当加酶量为300 U/g时，提取率最高，达33.31%。这是因为细胞壁被果胶酶不断裂解，蛋白质暴露出来逐渐变多，蛋白的溶出率也因此增加，蛋白提取率不断升高。随着酶量不断增加，酶浓度增大，使得游离酶与蛋白质进一步相互作用，抑制了酶活力，蛋白质提取率提升速度变慢。

2.3 藜麦秸秆蛋白正交试验结果

从表2可以看出，影响藜麦秸秆蛋白提取率的因素由大到小依次为A、C、B，即温度对蛋白提取率影响最大，其次为加酶量，提取时间对蛋白提取率影响最小。以藜麦秸秆蛋白提取率为指标，得到最佳纯化工艺为A2B1C2，即提取温度50 ℃，提取时间8 h，纤维素添加量275 U/g时，藜麦秸秆蛋白提取率最高，提取率为40.68%。

3 结论

分别利用纤维素酶与果胶酶辅助提取藜麦秸秆中的蛋白质，以藜麦秸秆蛋白的提取率为指标，根据2种酶提取的试验结果，纤维素酶在提取藜麦秸秆蛋白的效果优于果胶酶。选用纤维素酶提取藜麦秸秆蛋白进行正交试验，结果表明，藜麦秸秆蛋白提取率影响因素中温度影响最大，加酶量影响次之，提取时间对其影响最小，优化得到最佳工艺：温度50 ℃、时间8 h、纤维素酶添加量275 U/g，在此条件下进行验证得到的蛋白质提取率为40.68%。结果表明，酶法辅助提取是一种有效安全的提取藜麦秸秆蛋白的方法，减少了藜麦秸秆的浪费，充分利用了藜麦秸秆的价值，并为藜麦秸秆中蛋白质的开发利用提供理论依据。

参考文献

[1] 任贵兴，杨修仕，么杨.中国藜麦产业现状[J].作物杂志，2015（5）：1-5.

[2] NAVRUZ-VARLI S，SANLIER N.Nutritional and health benefits of quinoa（Chenopodium quinoa Willd.）[J].Journal of cereal science，2016，69：371-376.

[3] NOWAK V，DU J，CHARRONDIRE U R.Assessment of the nutritional composition of quinoa （Chenopodium quinoa Willd.）[J].Food chemistry，2016，193：47-54.

[4] 任妍婧，谢薇，江帆，等.藜麦粉营养成分及抗氧化活性研究[J].中国粮油学报，2019，34（3）：13-18.

[5] 魏爱春，杨修仕，么杨，等.藜麦营养功能成分及生物活性研究进展[J].食品科学，2015，36（15）：272-276.

[6] SCHILICK G，BUBENHEIM D L.Quinoa：An emerging newcrop with potential for CELSS[M].Washington：National Aeronautics and Space Administration，Ames Research Center，1993.

[7] 肖正春，张广伦.藜麦及其资源开发利用[J].中国野生植物资源，2014，33（2）：62-66.

[8] 肖崇厚.中药化学[M].上海：上海科学技术出版社，1997.

[9] 王雅洁.生物分离纯化实践技术[M].南京：东南大学出版社，2016.

[10] 李婉涛，张京和.动物遗传育种[M].2版.北京：中国农业大学出版社，2011.

[11] 鲁吉珂，黎业娟，吴霄玥，等.有机溶剂沉淀法提取乳酸链球菌素的效果[J].食品科学，2012，33（10）：84-86.

[12] 施曼，高岩，易能，等.植物叶蛋白提取及脱色研究進展[J].食品工业科技，2017，38（21）：342-346，351.

[13] 曾凡枝，田丽萍，薛琳，等.纤维素酶在苜蓿叶蛋白提取中的应用[J].湖北农业科学，2008，47（7）：830-832.

[14] 田旭静，段鹏慧，陈文超，等.Osborne 分级法提取藜麦糠清蛋白及功能性质研究[J].食品工业科技，2017，38（12）：264-269，276.

[15] 王蕾，田少君，张争全.纤维素酶辅助碱法提取米糠蛋白的工艺优化[J].粮食与油脂，2019，32（4）：44-47.

[16] 章绍兵，王璋.水酶法从菜籽中提取油及水解蛋白的研究[J].农业工程学报，2007，23（9）：213-219.

[17] 范恒君.酶法水解植物蛋白[J].南宁职业技术学院学报，2000，5（3）：57-61.