二维纳米材料用于生物传感的研究

张文先， 钱 玲， 姜 念， 彭 强， 岳婉晴*

(中国药科大学理学院，江苏南京 211198)

1 前言

近年来，生物传感技术得到了长足的发展，已广泛地应用于疾病诊断、临床治疗、环境监测、食品安全等领域[1]。基于各种分析技术，包括比色[2]、荧光[3]、液滴微流控[4]、微流控纸基[5]等方法。生物传感器目前已被开发用于生物小分子[6]、核酸[7]、蛋白质[8]和细胞[9]的分析。为了提高分析性能，研究人员引入了各种具有独特的化学和物理特性的纳米材料来构建生物传感器。纳米材料可以作为载体搭载信号标记物，或直接作为信号报告者敏感地检测生物标记物[10]。二维纳米材料是应用于生物传感的众多纳米材料中相对新颖且性质独特的成员。到目前为止，二维纳米材料及其纳米复合材料在物理学、化学、光学和电子学等领域的表现都很出色，这促进了它们在催化、能源、传感、生物成像、抗菌、药物输送和治疗方面的广泛应用[11]。

在过去的十几年中，我们见证了使用二维纳米材料进行生物传感应用的快速发展[12]。本综述主要关注基于比色、荧光、液滴微流控和微流控纸基分析方法的二维纳米材料用于生物传感的最新进展。

2 二维纳米材料

2004年，Novoselov和Geim[13]利用微机械剥离法成功地将石墨烯从石墨中剥离出来，自此二维纳米材料的探索呈现井喷式发展。超薄的二维纳米材料具有片状结构，横向尺寸大于100 nm或达到几μm以上，但其厚度只有单原子或几个原子厚度(一般小于5 nm)[14]。二维纳米材料中的电子被禁锢在二维空间里，能够获得独特的物理和化学性能，如宽广的比表面积[15]、宽泛的可调谐带隙[15]、高载流子迁移率[16]等。目前二维纳米材料已广泛地应用于光电器件、催化、生物医药、能源等领域，是近年来材料科学的研究热点之一。

2.1 二维纳米材料的晶体结构

二维纳米材料的物理、化学特性很大程度上取决于它们的原子排列[17]。尽管存在组分和结构上的差异，但二维纳米材料一般可以分为层状和非层状[18]。层状二维纳米材料的每个平面内原子通过每层中的强的化学键连接，各层之间则是通过弱的范德华力相互作用堆叠在一起[19]。最典型的层状化合物是石墨烯，其中每个原子通过σ键与三个相邻原子在平面上共价相连，层与层之间存在弱的范德华力相互作用[20]。层状双氢氧化物(Layered Double Hydroxides，LDHs)[21]、过渡金属二硫化物(Transition Metal Dichalcogenides，TMDs)[2]、单原子层单质二维材料(Xenes)[22]、六方氮化硼(Hexagonal Boron Nitride，h-BN)[23]、金属碳化物/氮化物(Metal Carbides/Nitrides，MXenes)[24]、石墨氮化碳(Graphitic Carbon Nitride，g-C3N4)[25]和金属有机框架(Metal-Organic Frameworks，MOFs)[26]也具有类似石墨烯的结晶结构。相比之下，非层状纳米材料，如二维金属、金属氧化物/钙化物等[27]，通过原子/化学键在三维空间结晶而形成块状晶体。受特定的原子排列、原子间的配位模式或层间的堆积顺序的影响，这些非层状纳米材料可以结晶成不同的晶相，极大地影响了它们的性质和功能[28]。

2.2 二维纳米材料的合成方法

常见的二维纳米材料的合成方法有两类，分别为自下而上和自上而下的方法。自下而上的方法通常从小的有机或无机分子/原子开始，采用晶体生长/组装成二维有序结构，包括经典的化学气相沉积法(Chemical Vapor Deposition，CVD)[29]、化学气相传输法(Chemical Vapor Transmission，CVT)[23]、湿化学合成法[30]和晶体的自组装法[31]等。自上而下的方法旨在通过各种驱动力(机械/液相/离子夹杂和剥落)来打破具层状结构的材料中层间微弱的范德华力相互作用[32]。常用的自上而下法包括机械剥离法[33]、液相剥离法[34]、锂离子插层剥离法[35]等，这些方式相对简单但存在一定的缺点和局限性。以MoS2纳米片的合成为例，机械剥离法[33]的效率较低，尺寸较小且不均一，只适用于实验室研究，不利于大规模生产；常规液相剥离法难以去除高沸点有机溶剂[34]；锂离子插层过程不仅需要较长的时间(如3 d)和较高的温度(如100 ℃)，而且会导致MoS2由半导体转变为金属相[35]。

3 二维纳米材料用于生物传感的研究方法

生物传感器(Biosensor)在特定环境中具有高灵敏度、高选择性和高稳定性，在医学、生物学、环境监测以及发酵工业等领域引起人们的极大关注[28]。二维纳米材料具有独特的性质，如优良的导电性、高比表面积、优异的荧光猝灭能力等。基于二维纳米材料和比色、荧光和微流控技术可以构建不同的传感系统，用于多种目标物的检测。

3.1 比色法

2010年，Qu[36]课题组首次发现羧基修饰的氧化石墨烯(GO -COOH)具有内在的过氧化物酶样活性，并开发了一种用于葡萄糖检测的比色生物传感器(图1(a))。在这一突破性工作之后，其他二维纳米材料，包括PtS2[37]、MoS2[2]、VS2[38]和WS2[39]纳米片等也因其内在的过氧化物酶样活性而被用于构建检测葡萄糖的比色生物传感器。除了检测葡萄糖外，基于二维纳米材料的比色生物传感器还成功地用于分析抗坏血酸[40]、H2O2[40]、DNA[41]、谷胱甘肽(GSH)[42]等。研究表明二维纳米材料是负载酶、贵金属纳米颗粒、金属氧化物和有机化合物的理想基质，它们结合后形成纳米复合材料[45]。受纳米复合材料的组成成分的协同作用的影响，这些复合的二维纳米材料比纯二维纳米材料或单独的功能化基团具有更好的催化活性，可构建性能优异的生物传感体系。Chen[43]课题组在氧化石墨烯(GO)表面装饰铂纳米颗粒(PtNPs)，形成具有较高的类过氧化物酶活性的纳米复合材料(PtNPs/GO)。如图1(b)所示，H2O2和TMB在PtNP/GO的催化下分别产生 ·OH和氧化TMB(oxTMB)，溶液呈蓝色。由于谷胱甘肽(GSH)能与 ·OH反应，随着GSH的加入，TMB和H2O2的反应程度下降。该GSH比色生物传感器具有较宽的线性范围(0.02～20 μmol/L)、较低的检测限(4 nmol/L)和较短的检测时间(5 min)。

基于二维纳米材料可以构建比色传感器检测癌细胞。Tao[44]等人采用氨基-石墨烯纳米杂交材料作为比色标记物，通过修饰叶酸(FA)靶向识别癌细胞表面的叶酸受体，从而特异性地吸附在人宫颈癌细胞(HeLa)和人乳腺癌细胞(AuNCs MCFs-7)表面。他们结合金纳米簇设计了一种用于快速比色检测癌细胞的氧化石墨烯-金纳米簇(GO -AuNCs)纳米复合材料。该纳米复合材料表现出优异的类过氧化物酶活性，修饰叶酸后可用比色法检测低至1 000个MCF-7细胞(图1(c))。

图1 (a)利用GOx和GO -COOH催化反应对葡萄糖进行比色检测的示意图[36]。(b)谷胱甘肽检测工作原理示意图[43]。(c)FA-GO -AuNCs杂交体(GFA)的制备示意图和部分用于癌细胞检测的实验数据[44]。Fig.1 (a) Schematic illustration of colorimetric detection of glucose by using glucose oxidase and GO -COOH-catalyzed reactions[36] .(b) Schematic representation of the working principle of glutathione detection[43].(c) Schematic representation of preparation of FA-GO -AuNCs hybrid (GFA) and partially experimental data for cancer cell detection[44].

3.2 荧光法

大多数报道的二维纳米材料，如石墨烯、TMDs、h-BN和LDHs等，通常本身没有或存在微弱的荧光，这使得它们不能直接作为荧光探针用于传感应用[46]。2008年，Swathi[47]等人从理论上计算出石墨烯可以通过共振能量转移来猝灭染料的荧光，而这种能量转移很大程度上取决于石墨烯与染料之间的距离。Liu[48]课题组也利用不同长度的DNA序列，发现GO表面荧光信号的强弱与GO和荧光染料的距离存在相关性。二维纳米材料被进一步证明可以有效地抑制有机染料、无机量子点和上转换材料的荧光[45]。基于这一特性，二维纳米材料作为荧光猝灭剂，广泛地用于构建检测金属离子[49]、DNA/miRNA[50]、蛋白质[51]、细菌[52]和癌细胞[9]的荧光传感器。

2009年，Yang[3]课题组首先开发了基于石墨烯的生物分子检测传感平台(图2(a))，将羧基荧光素标记的单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)非共价结合在GO表面，染料的荧光被GO完全猝灭。随着目标DNA的加入，双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)的形成使染料标记的ssDNA从GO表面释放出来，恢复染料的荧光。同样的检测策略也可以用于凝血酶的检测。一年后，He等人[7]开发了一种基于石墨烯的纳米探针用于多色荧光DNA分析(图2(b))。三种染料标记的ssDNA探针同时被吸附在GO表面，染料的荧光发生猝灭。ssDNA探针只与特定靶基因序列杂交形成dsDNA，从而恢复染料的荧光。根据这一现象，可以用石墨烯基纳米探针同时检测p16、p21和p53基因。目前，基于石墨烯/GO的荧光生物传感器已用于蛋白质[8]、ATP[53]、凝血酶[54]和多巴胺[55]等生物分子的检测。同样，其他二维纳米材料，如PtS2、MoS2、WS2、g-C3N4等，也具有优异的荧光猝灭能力。

图2 (a)ssDNA-FAM-GO复合物的靶向诱导荧光变化的示意图[3]。(b)基于GO的多色DNA分析的方案。混合探针(P5，P6，P7)在不同目标T5(蓝色)，T6(红色)和T7(橙色)的存在下的荧光光谱，激发波长为494，643和587 nm[7]。Fig.2 (a) Schematic representation of the target-induced fluorescence change of the ssDNA-FAM-GO complex[3].(b) Scheme for the GO -based multicolor DNA analysis.Fluorescence spectra of mixture probes (P5,P6,P7) in the presence of different targets T5 (blue),T6 (red) and T7 (orange) with the excitation wavelengths of 494,643,and 587 nm[7] .

为了提高基于二维纳米材料的荧光生物传感器的分析性能，人们开发了各种与荧光生物传感器相耦合的信号放大策略。Chen等人[56]报道了一种外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)辅助放大的GO传感平台，用于检测溶菌酶(Lys)蛋白。包含Lys适配体序列的发夹探针(HP)在与目标蛋白结合时表现出构象变化。这种构象变化暴露了单链尾序列，促进了Exo Ⅲ辅助扩增和多个信号探针(SP)的循环酶切，释放荧光基团。没有靶标的情况下，HP中没有单链尾序列暴露，SP不能与HP杂交，避免了SP被Exo Ⅲ酶切。加入GO后，与单链SP结合的荧光基团发生荧光猝灭。由于被酶切后释放的短DNA片段和GO之间无相互作用，释放的荧光基团不会发生荧光猝灭(图3(a))。

二维纳米材料具有良好的生物相容性和较大的表面积，被认为是负载荧光探针进行生物分子原位成像分析的理想基质。Oudeng等人[9]开发了一种基于MoS2的荧光探针来测定癌细胞中miRNA-21的表达。如图3(b)所示，将叶酸、聚乙二醇(PEG)和染料标记的ssDNA在MoS2纳米片表面共官能化，构建了基于MoS2的荧光“开-关”探针。结果表明，MCF-7细胞的荧光恢复信号比HeLa细胞高58.7%，证明了miRNA-21在MCF-7细胞中高表达。

除了作为猝灭剂，本身具有荧光的二维纳米材料也可作为荧光标记用于构建荧光生物传感器。Seo课题组[57]构建了一种基于GO和金纳米粒子(AuNPs)之间荧光共振能量转移作用的免疫传感器，并用于病原体分析。如图3(c)所示，GO具有强烈的荧光发射，加入目标病原体后，形成了经典的三明治免疫结构，由于AuNPs的猝灭作用，GO的荧光发射下降。该免疫传感器可以检测105pFU/mL的目标轮状病毒，并能有效区分轮状病毒与脊髓灰质炎病毒。

图3 (a)Exo Ⅲ辅助扩增检测Lys的示意图[56]。(b)用于细胞内miRNA-21检测的基于ssDNA-MoS2-PEG-FA探针的荧光共振能量转移平台的示意图[9]。(c)以GO为荧光标记构建免疫传感器的示意图[57]。Fig.3 (a) Schematic representation of Exo Ⅲ aided amplification assay for Lys detection[56].(b) Schematic of ssDNA-MoS2-PEG-FA probe-based fluorescence resonance energy transfer platform for intracellular miRNA-21 detection[9].(c) Schematic representation of an immuno -biosensor using GO as a fluorescent label[57].

基于二维纳米材料的荧光猝灭能力或本身具有的荧光，我们可以开发灵敏度高、响应时间短、成本低的荧光生物传感器用于分子诊断、疾病诊断、食品和环境监测等领域。

3.3 液滴微流控分析方法

随着液滴技术的发展，基于液滴的微流控技术已较为广泛地应用于生物传感[4]。液滴微流控是一种利用互不相溶的两液相产生分散的微液滴进行实验操作的非连续流微流控技术[58]。在两相界面处的表面张力和剪切力的共同作用下，可在微流控芯片中形成大小均一的微液滴。与基于层流的微流控技术相比[59]，液滴作为一种与溶液反应等效的微反应器，不仅可以减少试剂消耗，加快试剂混合，缩短反应时间，而且可以大大减少试剂的分散、固定、孵育时间和交叉污染，并能精确控制溶液体积[4]。

Xiang等人[4]利用GO纳米探针，开发了一种基于液滴的多路DNA分析生物传感器，如图4(a)所示。借助液滴操纵技术，准确实现了液滴大小的调整、液滴的融合和液滴的收集。由于GO具有较高的荧光猝灭效率，在没有目标DNA的情况下，含有两种荧光染料标记的ssDNA探针和GO的液滴呈现深色，荧光猝灭；dsDNA的形成会导致荧光基团远离GO，液滴由深色变为亮色，荧光恢复。该生物传感器具有高通量、低消耗的同时定量检测两种DNA的能力。

图4 (a)微流控液滴平台和通过GO纳米探针进行多路DNA定量的生物传感器的示意图[4]。(b)结合HRP-AuNCs检测单细胞包被液滴中过氧化氢的示意图[60]。Fig.4 (a) Schematic representation of a microfluidic droplet platform and a biosensor for multiplexed DNA quantification via GO nanoprobes[4]. (b) Schematic representation of combined HRP-AuNCs for detection of hydrogen peroxide in single cell-encapsulated droplets[60].

2019年，Shen等人[60]开发了一种微流控方法，利用液滴与金纳米簇(AuNCs)结合来灵敏地检测单个细胞分泌的H2O2(图4(b))。在超小体积(4.2 nL)的微滴下，单细胞分泌的H2O2可以引发HRP-AuNCs的荧光变化。该传感器可从单个细胞直接测量200～400 amu H2O2，具有超高的灵敏度和良好的特异性，可用于研究单细胞分泌H2O2的差异，从而探究细胞的异质性。

基于液滴的微流控技术相对于传统生物检测的主要优势包括它能够为反应提供高度均匀、良好隔离的环境，并具有更高的通量。基于二维纳米材料的液滴生物传感器通常具有灵敏度高、检测时间短和试剂消耗低等优点，对于检测和分析少量的生物分子，如抗体、生物小分子和单基因组等至关重要。

3.4 微流控纸基分析方法

微流控纸基分析设备(Microfluidic Paper-Based Analytic Devices，μPADs)作为一种强大的工具可在生化分析、食品安全、环境监测、临床即时检测(Point-of-Care Testing，POCT)等领域进行快速定性和定量分析，可集成包括化学发光、质谱分析、比色和电化学方法在内的不同检测技术[62]。结合纸带的方便测试和微流体的多功能性，μPADs具有简单、成本低、直观检测、高通量、可移植性和最小样品消耗等优点[63]。由纤维素组成的纸张内部具有多孔结构，液体流动依靠内在的毛细管作用，从而不需要外部力量或配件[62]。此外，作为μPADs的主要组件，白色的纸基可以提供高对比度颜色指标，对目标物的可视化分析得以定性或定量实现。

二维纳米材料具有独特的光学和催化性质，现已有研究将二维纳米材料与μPADs结合进行高性能的生物传感。图5(a)中，Figueredo等人[5]将三种不同类型的纳米材料，即Fe3O4磁性纳米颗粒(MNPs)、多壁碳纳米管(MWCNTs)和GO应用于纸基分析装置中，以提高颜色测量的均匀性。在葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)的协助下，用MNPs、MWCNTs和GO处理的μPADs的检测限分别为43 μmol/L、62 μmol/L和18 μmol/L。

图5 (a)μPADs的构造程序示意图，显示了MNPs、MWCNT和GO处理步骤，以及涉及扫描仪和像素强度分析的比色检测程序[5]。(b)基于纸张的微流控装置用于总脂质分析的示意图[61]。Fig.5 (a)Schematic representation of the construction procedure of the μPADs showing the treatment step with MNPs,MWCNT,and GO as well as the procedure required for colorimetric detection involving scanner and pixel intensity analysis[5]. (b) Schematic representation of a paper-based microfluidic device for total lipid analysis[61].

Parween等人[61]报道了一种使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和AuNPs的新型纸基表面改性方法，如图5(b)所示。使用这种功能化的μPADs可同时测定总胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)和甘油三酯(TGL)四种总脂质谱(TLP)。该纸基分析方法的测试结果与传统方法相比有很好的相关性。该检测装置价格适中、携带方便、自测快速，旨在帮助筛查个人的血脂水平，可方便地用于临床检测。

与传统的生物分析相比，基于二维纳米材料的微流控纸基生物传感器具有众多的优点和巨大的潜力，如便携性、低成本、快速反应、出色的选择性和敏感性等。目前，微流控纸基生物传感技术仍处于发展阶段。通过引入二维纳米材料构建的检测方法可以更方便、更可靠地完成目标物的分析。我们应开发更多性能更为优良的二维纳米材料，以满足微流控纸基生物传感装置发展的需要。

4 总结和展望

二维纳米材料作为材料领域的重要成员之一，在生物传感器的开发中具有很高的应用价值。生物传感在医学、生物学、环境监测等领域的应用需求日益增长，为基于二维纳米材料的生物传感器的开发带来了巨大的机遇。通过优化合成方法和改进合成技术，可大规模获得结构可控的高质量的二维纳米材料，为开发高性能和可重复使用的生物传感器提供了理想的材料。在基于二维材料的生物传感器中引入信号放大策略，可进一步提高检测的灵敏度，实现对微量或痕量物质的检测。然而需要指出的是，目前二维纳米材料在生物传感方面的研究仍处于初级阶段，在应用过程中仍有一些挑战需要克服。一个主要的挑战是进一步研究生物分子和二维纳米材料的相互作用机制。生物分子在二维纳米材料表面的数量和排列方式会影响基于二维纳米材料的生物传感器的分析性能。另一个挑战是进一步提高生物传感器的稳定性和重现性，实现生物传感装置的实际应用价值。

基于二维纳米材料的生物传感器的高性能很大程度上依赖于材料高质量的平面形貌，这就需要更有效的合成方法和进一步的功能化。目前，用于构建生物传感器的大部分材料的二维尺寸通常不均匀，这将影响传感器的灵敏度、稳定性和重现性。通过开发性能优异的二维纳米材料、改进材料的合成方法或进行表面功能化、探究生物分子与二维纳米材料的相互作用，我们相信基于二维纳米材料的生物传感器在生物医学、环境科学等领域具有广阔的应用前景。