介孔二氧化硅包载香叶木素对IL-1β诱导的大鼠体外骨关节炎的作用研究

何明为 韦庆军

摘要：目的：对比MSNs@DM和单纯DM对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞炎症损伤的作用。方法：提取5天龄的SD乳鼠的软骨细胞进行培养，分为空白对照组（Control），骨关节炎组（OA），香叶木素组（DM），载药组（MSNs@DM），分别处理24小时后，行HE染色观察各组大鼠的细胞形态及数量，并提取各组大鼠的总RNA，行qRT-PCR检测相关炎症的表达。结果：与OA组相比，DM组和MSNs@DM组细胞形态较接近于Control组;在细胞数量上，MSNs@DM组和DM组均比OA组多，而且MSNs@DM组相较于DM组多。MSNs@DM组相关炎症指标基因的表达均低于OA组（P<0.05）和DM组（P<0.05）。结论：MSNs@DM相比于单纯DM更能有效维持IL-1β诱导的大鼠体软骨细胞炎症损伤的形态，并抑制相关炎症基因的表达，对骨关节炎有积极的治疗作用。

关键词：介孔二氧化硅;香叶木素;软骨细胞;骨关节炎

【中图分类号】R-03 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2020）01-026-02

骨关节炎（osteoarthritis， OA）是一种以关节软骨退行性改变为特征的疾病，会引起关节疼痛、僵硬、压痛和活动范围缩小等，是常见的肌肉骨骼疾病之一[1]。目前治疗OA的方式有止痛药物（如扑热息痛和非甾体抗炎药）、手术等[2]。然而这些治疗仅能缓解症状，很难延缓OA的发展。有研究表明，香叶木素（diosmetin， DM）具有较强的抗炎、抗氧化作用[3]，是治疗OA的潜力药物;但是由于DM水溶性差、不利于吸收的特点，药物的实际利用率较低。介孔结构的二氧化硅纳米颗粒（mesoporous silica nanoparticles， MSNs），由于具有极高的比表面积和孔径体积，已被作为药物缓释载体应用于生物医学研究中[4]。因此，本研究以MSNs为载体负载DM（MSNs@DM），研究其对IL-1β诱导的大鼠体外骨关节炎的影响，为今后进一步研究新型的OA治疗方式提供实验依据。

1.材料与统计学方法

1.1 材料 动物为5天龄SD乳鼠，由广西医科大学动物实验中心提供。主要试剂：MSNs、DM（化学结构式如图1A）购于麦克林公司（http：//www.macklin.cn/）;高糖培养基、胰蛋白酶、双抗、MTT和HE染色试剂盒购买于北京索来宝公司（http：//www.solarbio.com/）;PCR引物合成于武汉金开瑞生物公司;胎牛血清购买于Gibco公司。主要仪器：全波长荧光酶标仪（Thermo，美国）;正置荧光显微镜（Olympus，日本），PCR仪（light-cycler，美国）。

1.2 统计学方法 以SPSS 22.0统计软件处理数据，并以（均数±标准差）呈示。组间比较采用One-way ANOVA，两两比较采用LSD检验，P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2.方法与结果

2.1 DM对IL-1β体外诱导的大鼠软骨细胞炎症损伤的作用

提取SD乳鼠原代软骨细胞进行培养至第3代。将软骨细胞接种于96孔板，每孔5×103个细胞，放置于37℃培养箱中培养。待细胞完全贴壁后，先加入含有不同浓度DM的高糖培養基（含10%胎牛血清和1%双抗）作用2小时，随后更换含有相同浓度DM的高糖培养基（含IL-1β 10ng/mL，10%胎牛血清和1%双抗）。作用24小时后，分别向每孔培养基中加入20μL的MTT，继续置于培养箱中4小时后弃掉多余培养基，加入200μL DMSO并避光孵育15-20分钟。最后用全波长荧光酶标仪在570nm处测定光密度值（OD value）。结果如图1B所示，DM在20μM 时，对经IL-1β体外诱导的大鼠软骨细胞保护效果最佳。

2.2 MSNs@DM对IL-1β体外诱导的大鼠软骨细胞炎症损伤的作用

为对比MSNs@DM和DM对IL-1β （10ng/mL）体外诱导的大鼠软骨细胞的作用，我们以MSNs作为药物载体，按照等效浓度为20μM的量将DM载入MSNs中得到含20μM 的MSNs@DM。之后，我们将第3代软骨细胞分别接种在6孔板（50×103个/孔）及24孔板（10×103个/孔）爬片中，分别为Control组，OA组，DM组，MSNs@DM组。按如前所述分组分别加入含不同药物成分的培养基作用2小时后，更换含有相应药物成分的且含有IL-1β （10ng/mL）的高糖培养基。在干预24小时后，我们分别取出各组细胞爬片，用PBS缓冲液冲洗3遍后以多聚甲醛在室温下固定20分钟，之后进行HE染色。染色结果如图2，苏木素将细胞核染成蓝色，伊红将细胞质染成红色。同OA组对比，我们发现DM组和MSNs@DM组细胞形态和数量更接近于Control组;并且OA组的细胞形态狭长且数量减少，说明IL-1β能诱导软骨细胞的炎症损伤。此外，我们还从6孔板中提取了各组细胞的总RNA并进行qRT-PCR检测了炎症因子的表达（MMP3、MMP13和IL6）。本研究所用引物：MMP3（上游：GGCTGTGTGCTCATCCTACC;下游：TGGAAAGGTACTGA AGCCACC）;MMP13（上游：GGACAAAGACTATCCCCGCC;下游：GGCATGACTCTCACAATGCG）; IL6（上游： ACAAGTCCGGAGA GGAGACT;下游： ACAGTGCATCATCGCTGTTC）;GAPDH（上游：TCCAGTATGACTCTACCCACG;下游：CACGACATACTCA GCACCAG）。PCR结果如图3所示：与Control组对比，炎症指标MMP3、MMP13和IL6均明显升高（p<0.05）。而对比DM组，MSNs@DM组的炎症指标表达更低（p<0.05）。以上结果提示MSNs@DM组比DM组更能有效抑制IL-1β诱导的软骨细胞损伤。

3.讨论

OA是全球老年人最常见的关节疾病，也是慢性肌肉骨骼疼痛和行动不便的主要原因[5]。目前对于OA尚无最佳的治疗方式，OA进展到晚期需要进行关节置换术才能减轻疼痛和改善身体功能。因此，寻找能延缓OA进展的方式将能为临床治疗提供指导性意义。

研究表明，IL-1β可引起软骨细胞中的基质金属蛋白酶类MMPs、IL6、TNF-α等炎症因子合成、分泌及活性增加[6]，导致软骨细胞基质降解进而导致关节软骨的退变，最终发展为骨关节炎。DM是天然黄酮类化合物的一种，广泛存在于甘菊蓝、紫草和薄荷等天然植物中，具有抗炎、抗氧化、抗休克等功效[7]。有研究报道，DM可通过抑制破骨细胞的分化，降低软骨下骨的丢失，进而对小鼠的骨关节炎有一定的治疗作用[8]。然而，由于裸露在细胞外环境中的DM水溶性差，易被细胞外环境所代谢，以致细胞的药物吸收率降低。因此，本研究使用具有缓释作用的药物载体MSNs包载DM，可以实现药物载细胞外环境中的缓慢释放，是之持续有效地对细胞起到保护作用。本实验研究发现，IL-1β （10ng/mL）诱导后的软骨细胞其炎症指标如MMP3、MMP13和IL6等表达量明显增加。而在DM作用后，其炎症指标有所降低，我们的研究结果除了进一步验证了DM对软骨细胞验证损伤的保护作用之外，我们还发现了经MSNs包载的DM，对软骨细胞的验证损伤效果比单纯药物DM的治疗更佳，提示了MSNs可作为药物载体包载药物并运用在体外骨关节炎的治疗中。

综上所述，MSNs@DM比单纯DM对IL-1β诱导的体外软骨细胞的损伤的保护作用更佳，能为OA的治疗提供新的思路。

参考文献：

[1]Xiao， L.， D. Williams， and M.M. Hurley， Inhibition of FGFR Signaling Partially Rescues Osteoarthritis in Mice Overexpressing High Molecular Weight FGF2 Isoforms. Endocrinology， 2020. 161（1）.

[2]王晶璐， 黄芩素对IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞NF-κB信号通路的影响. 东北农业大学.

[3]Patel， K.， et al.， A Review on Pharmacological and Analytical Aspects of Diosmetin：A Concise Report. Chinese Journal of Integrative Medicine， 2013. 2（10）： p. 46-52.

[4]Wahba， S.M.R.， et al.， Sugarcane bagasse lignin， and silica gel and magneto-silica as drug vehicles for development of innocuous methotrexate drug against rheumatoid arthritis disease in albino rats. Materials Science & Engineering C. 48： p. 599-610.

[5]Chen， Y.， et al.， Association between bisphosphonate use and risk of undergoing knee replacement in patients with osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases， 2018. 78（2）： p. annrheumdis-2018-212998.

[6]He， Y.， et al.， Costunolide inhibits matrix metalloproteinases expression and osteoarthritis via the NFkappaB and Wnt/betacatenin signaling pathways. Mol Med Rep， 2019. 20（1）： p. 312-322.

[7]Cameron， M. and S. Chrubasik， Oral herbal therapies for treating osteoarthritis. 2013.

[8]丁洪志， et al.， 香葉木素通过抑制破骨细胞分化治疗早期骨关节炎的可行性研究. 实用药物与临床， 2019. 22（10）： p. 1023-1029.

基金项目：广西研究生教育创新计划项目（YCSW2019109）

（1.广西生物医药协同创新中心 广西南宁 530021;2 广西医科大学第一附属医院 创伤骨科手外科 广西南宁 530021）