呼吸道病毒实验室检测技术

鲁健康

呼吸道感染是临床上最多见的一种症状，也是引起疾病和死亡的重要因素。可引发呼吸道感染的病原菌有很多种，比如细菌、病毒、衣原体和支原体等，特别是病毒感染更多见。無论是哪种病原菌引起的感染，呼吸道感染的临床表现都比较相似，但治疗方法却截然不同，所以，需要快速准确检测出到底是感染了哪种病原菌，然后对症治疗，才能获得有效的治疗效果。在分子生物技术快速发展的今天，呼吸道病毒的检测方法也不仅仅只依靠分离培养和免疫学技术，基因芯片和下一代测序技术等都获得了广泛应用，而且检测效果更快、更灵敏，同时还具有特异性和高通量等，可满足疾病治疗的需求，下面我们一起了解下呼吸道病毒实验室检测技术。

1 、病毒分离培养

病毒分离培养法是呼吸道病毒检测方法中最经典的一种，也是诊断的金标准。传统的方法是将鼻咽的分泌物接种在敏感细胞，使用含2%小牛血清作为培养基，然后观察细胞状态，全过程需要大概7-15天左右，时间比较长，不利于疾病的早期诊断与治疗，而且有些病毒的阳性检出率比较低。20世纪90年代时，使用了载玻片培养，先采用低温离心然后再进行培养，隔天再使用单克隆抗体染色，可清楚查看到感染的细胞。该方法对病毒分离培养的时间需要1-2天，缩短的检测时间，为病人的治疗争取了更多有效时间。

2 、免疫学技术

直接免疫荧光技术指的是使用标有荧光素的抗病毒抗体和组织中的病毒抗原直接发生反应。该方法操作起来非常简单，时间也比较短，还具有较高的特异性和敏感性，更有利于实验室工作的进行，是常用的呼吸道病毒检测方法。但该方法需要使用鼻咽深部的分泌物，会使病人更加痛苦。

间接免疫荧光技术指的是首先选择相应病毒抗原与特异性抗体相结合，形成一种新的抗原抗体复合物，然后将该复合物与荧光标记的二抗进行反应，通过荧光显微镜去观察。该方法可以同时对多种病毒进行检查，但敏感性比较低，也会受到很多因素的影响。

酶联免疫吸附试验指的是利用抗原抗体的特异性与具有高效催化作用的酶相结合，检测出呼吸道病毒抗原，还能检测出相应病毒的抗体，该方法具有较高的敏感性，较强的特异性，而且也不存在放射性污染，所以是应用范围较广的实验室呼吸道病毒检测方法。

3 、芯片技术

芯片技术是对基因组学和蛋白质组学进行研究的一项有力工具。芯片技术与宏基因组学方法可快速鉴别诊断出病毒。该方法能够帮助发现新的病毒，就算病毒没有基因恒定区，也可通过测序获得检测结果，测序与微阵列芯片相结合也是一种非常强大的高通量诊断方法。

液相芯片技术是由很多大小一样的圆形微球构成，每个微球上都装有相应的荧光标记的分子探针，然后通过荧光信号去测定呼吸道病毒，该方法属于一种新型生物技术平台。

4 、下一代测序技术

从21世纪初，下一代测序就彻底改变了基因组学的领域，使得以前很多无法进行的实验都得到广泛开展。下一代测序具有多样本、多功能和高通量的特点提高了呼吸道病毒检测效果。

下一代测序技术发现了很多新病毒，很多病毒和菌株都是通过该方法鉴别检查出的，比如2013年发现的副流感病毒。下一代测序具有的高敏感性实在令人难以置信，该方法能同时检查多个病人的样本，准确检测出特定病原和病毒抗体，然后进行适当的治疗。与Sanger测序比较来说，下一代测序从单个碱基来讲存在一定的价格优势，但如果只从单个反应而讲，价格还是比较贵的，而且多数临床实验室对于该技术的认知不足，需求也不大。而且该技术从样本准备到完善数据需要两三天的时间，每个反应都会产生大量数据，需要具备丰富经验的具有专业生物信息技术的人员分析。虽然面临很多问题，但相信都会不断完善，最后下一代测序会在呼吸道病毒实验室检测中获得重要地位，发挥重要作用。

5 、纳米技术

纳米技术的出现也为科学发展开启了新的方向。当物质发生变化缩小到纳米级别时，就需要使用纳米技术进行检测，发挥它特有的功能。免疫聚合酶链反应是酶联免疫吸附试验与聚合酶链反应的结合，常用于多种病毒和细菌的检测。有研究人员使用金标的纳米颗粒改进免疫聚合酶链反应检测出呼吸道合胞病毒，检出率能达4.1pfu/ml，该方法的检测敏感性要比聚合酶链反应的敏感性高出4000倍之多。

若想建立起该种检查体系对呼吸道病毒进行检测，还是比较难的，特别是病毒感染的初期阶段。但由于分子标记技术的出现，活细胞追踪成为可能，所以成功检测出呼吸道合胞病毒。

总之，呼吸道病毒是造成呼吸道感染的重要因素，在众多抗病毒药物的广泛使用，很多病毒对于常用药物都会产生耐药性，而且还有新的病毒在不断威胁大家的健康，所以需要一种快速、灵敏且具有特异性的检测方法来控制疾病的爆发，也避免乱用药物。传统的常用的病毒检测方法是病毒分离培养法，虽然具有检测的金标准，但用时比较长，很难应用于临床治疗。免疫荧光法，可在几个小时内完成检测，是目前临床常用的病毒检测方法。此外，还有芯片技术、下一代测序技术、纳米技术以及质谱分析技术等。目前，分子检测技术具有高灵敏度、用时短和高特异性等特点日益成熟。

（西昌市疾病预防控制中心 四川 西昌 615000）