采用色谱级大孔吸附树脂分离林可霉素B组分的研究

王晓军 丁立波 锁嘉伟 梁友辉

摘要：林可霉素是合成克林霉素的前体物质，其天然成分中的林可霉素B组分的含量对于产品质量和后续合成产物有较大影响。本研究通过采用色谱级大孔吸附树脂，在0.6MPa、20mg/ml的进样浓度下进行压力吸附、以不同浓度磷酸-丙酮/水溶剂进行梯度洗脱的处理工艺，得到的林可霉素解析液中的林可霉素B组分含量由3.5%降低至0.6%，并且林可霉素A组分收率不低于92%。

Abstract： lincomycin is a precursor for the synthesis of clindamycin. The content of lincomycin B in its natural component has a great influence on the product quality and subsequent synthetic products. In this study， the content of lincomycin B in Lincomycin eluent was reduced from 3.5% to 0.6%， and the yield of lincomycin a was not less than 92% by using chromatographic grade macroporous resin， pressure adsorption at 0.6MPa and 20mg / ml injection concentration， and gradient elution with different concentrations of phosphoric acid acetone / water solvent.

林可霉素（Lincomycin）又称洁霉素，是最早被发现的林可酰胺类抗生素之一，其包含两种天然组分：林可霉素A与林可霉素B。其能高效的抗大多数革兰氏阳性菌和少量厌氧的革兰氏阴性菌，其通过作用于敏感菌的 50S 亚基，阻止肽链的延长，从而影响蛋白质的合成而达到抗菌效果。【1】其本身的毒性较低，且和其他绝大多数抗生素不会产生交叉耐药性，临床上广泛用于由革兰氏阳性菌感染所产生的疾病。其主要合成衍生物克林霉素以氯离子取代林可霉素分子中第7位的羟基的方式合成。其用途主要用来对抗各种感染性疾病，抗菌活性强，抗菌谱广，对革兰氏阳性菌具有明显抗菌活性。对衣原体、支原体、恶性疟原虫和弓形虫亦有杀灭作用。但无论是直接以林可霉素作为抗菌药物使用，还是以林可霉素为原料制备下游产品如克林霉素，都对其原料中的林可霉素B（以下简称“B组分”）有着较高的要求，从市场需求情况看，B组分含量高于1.5%的林可霉素产品基本没有任何市场。【2】因此通过提取工艺手段将发酵产物中的B组分含量降低至合理水平，是提升林可霉素产业价值的重要环节。【3，4】

色谱级大孔吸附树脂与传统大孔吸附树脂相比，其主要区别是树脂粒度更细密，耐高压且拥有较强的表面吸附能力，在进行吸附洗脱过程中，可以达到传统层析填料的富集和分离效果，同时具备吸附树脂选择性强、损耗少，可重复使用的优点，能够极大程度的降低成本，是一类新型纯化填料【5】。本研究采用HP20SS、HC色谱3型这两种色谱级大孔吸附树脂，通过中低压吸附以及复合溶剂洗脱的方式，提純林可霉素碱化滤液，降低B组分含量【6】。

1 材料与设备

表1与表2的内容为本研究所使用的主要原料与设备仪器。

2 实验与结果

本实验以林可霉素发酵液为原料，通过碱处理、过滤得到含有林可霉素A、B组分的碱处理滤液，分别采用两种色谱级大孔吸附树脂进行吸附，考察两组分在不同树脂中的吸附效率，并通过梯度洗脱的结果确定树脂型号及最优控制参数。

2.1 实验准备

使用1mol/L的氢氧化钠溶液，将林可霉素发酵液预处理过滤后得到的滤液pH调节至9.5～10.0，20℃静置2h，用中速滤纸二次过滤;以HPLC外标法检测林可霉素A、B组分含量【7】，并使用去离子水稀释至4000ug/ml左右，得到林可霉素碱化液，其中A组分含量85.2%，B组分含量3.5%。

在两支60×900mm不锈钢层析柱内，分别以湿式填装法填装1500mlHP20SS和HC色谱3型色谱级大孔吸附树脂，填装高径比约为8左右。静置至树脂完全沉降堆积后，封闭层析柱，连接磁力泵系统。将层析柱尾接管与全自动部分收集器连接，完成设备准备工作。

2.2 吸附实验

将林可霉素碱化液导入进料混合瓶，以3L/h的固定流速压入层析柱，层析柱出液口阀门开启，开始计量。出液量达到1000ml时启动自动部分收集器，每200ml样品取样进行HPLC检测，计算林可霉素A组分、B组分浓度变化。实验结果如下所示：

两种树脂在吸附水平上表现出了较为明显的差异，HP20SS在A组分吸附容量上表现出了较明显的优势，为19.2g/L，同时A组分与B组分穿透体积有明显差距，这说明该型树脂对与两种组分的吸附效率有明显差异。而HC色谱3型树脂在各项指标上与HP20SS树脂存在一定差距，因此本研究最终选择HP20SS作为最优选项。

2.3 解析实验

结合HP20SS吸附活性集团本身性质以及林可霉素溶解性，以磷酸的丙酮水溶液作为解析剂，分别以磷酸0.2mol/升的25%丙酮水溶液和0.2mol/升的40%丙酮水溶液作为解析剂进行洗脱，实验结果如下。

25%的丙酮水溶液解析过程可以看出，随着解析体积的增加，林可霉素A组分的解析量在逐渐增加，当解析量达1800ml时，解析效果明显下降，但此时B组分仍然未能解析出来。

此时更换为高浓度的40%丙酮水溶液，林可霉素A的解析效率再次提高，峰值单位含量最高可达到28550ug/ml，解析至2600ml时，A组分浓度再次下降，至2800ml时，HPLC检测结果中开始出现B组分含量检出。解析至3200ml，A组分含量接近平缓，而此时B组分含量已经开始上升，此时结束解析。将前部解析液收集混合后进行检测，A组分含量为93.23%，B组分含量低于0.6%。以上述解析液继续制备林可霉素，制的的成品A组分含量大于93%，B组分含量小于0.6%，完全达到降低B组分含量的目的。产品收率与原工艺相较下降1.2%，在合理范围内。

3 分析与讨论

通过本项目研究结果可以看出，色谱级大孔吸附树脂对于林可霉素A、B两组分的化学吸附能力有明显差异，HP20SS在吸附容量、吸附效率差异上有明显优势。通过二级浓度的磷酸-丙酮水溶液进行解析，能够有效分离林可霉素A、B组分，达到优化产品质量的目的。经过色谱级树脂层析处理后，林可霉素解析液A组分含量大于93%，B组分浓度低于0.6%，收率仅下降1.2%左右。

参考文献：

[1]庄智慧，高淑红，何岫峰，杨灿灿，秦振.响应面法优化林可霉素产量与组分[J].中国抗生素杂志，2018，43（08）：1049-1054.

[2]李华，张立，王鑫，王建国，谢书琴.林可霉素发酵工艺优化降低B组分[J].山东化工，2016，45（08）：63-64.

[3]葛友群， LX-20大孔树脂降低盐酸林可霉素B组分及单杂新工艺. 江西省，江西国药有限责任公司，2014-11-22.

[4]宋玉忠，祝立新，牛金刚，杜占彬，武培，袁岗，潘建超.利用大孔吸附树脂吸附降低林可霉素B组分的研究[J].中国现代药物应用，2012，6（07）：121-122.

[5]于泽源，赵剑辉，李兴国，徐雅琴，汤雪，杨昱.大孔树脂-中压柱层析联用分离纯化蓝莓花色苷[J].食品科学，2018，39（01）：118-123.

[6]王鑫芳，刘颖，李明江，檀晓燕.用薄层色谱法检测林可霉素B组分[J].中国生化药物杂志，2006（06）：371+382.

[7]张其洁.高效液相色谱法测定林可霉素B组分的含量[J].抗生素，1988（03）：224-225+192.

宁夏泰益欣生物科技有限公司 银川 贺兰 750205