5种中药多糖通过Keap1-Nrf2通路缓解代森锰锌氧化和卵巢毒性

张林超，宫英阑，温 冉，包佳鹭，张 妍，王晓丹

(河北农业大学 中兽医学院，河北 保定 071000)

代森锰锌(mancozeb，MCZ)是一种乙烯-二硫代氨基甲酸锰和锌盐的混合物，自1948年以来一直在多种农作物、观赏植物和草坪上广泛使用[1]。由于MCZ对广谱真菌及其相关植物病害的有效性，其在全球范围被广泛应用，且每年产量都有上升的趋势。另外MCZ在工业上也有广泛应用，如应用于糖业和造纸业；用作水冷却系统中的除黏剂；橡胶工业中的硫化促进剂和抗氧化剂；以及由于其螯合特性而在废水处理中用作清除剂[2]。然而，这种化学物质的大范围应用会通过一系列自然过程如地表径流漂移和浸出导致环境污染，并且以可测量的浓度存在于大气、土壤、地表水和地下水中对非目标生物体带来风险[3]。

PANGANIBAN等[4]发现，施用MCZ后可以在植物和环境(空气、土壤、水)中检测到MCZ的主要代谢产物乙烯硫脲(ETU)。MEDDA等[5]也发现在意大利应用较多MCZ的葡萄园附近，人群中ETU水平较高，平均值几乎达到12.2 μg/L。加拿大启用的几个农药检测项目发现，1994—2002年，已有16起鱼类死亡事件与MCZ径流事件有关[6]。MCZ被认为是一种潜在的雌激素干扰物和疑似致癌物[7]。研究表明，MCZ可以损伤女性的生殖系统[8]，影响健康卵泡的大小和数量[9]，使闭锁卵泡增加[10]，影响母体的受精能力；还可以改变雌性发情周期以及影响胚胎着床[11]。有研究发现，80%MCZ(Dithane-M45)暴露显著升高鸡胚的死亡率，损害鸡胚下肢的正常发育[12]。另外，奶牛吃了残留有MCZ的牧草后，MCZ会积聚在牛全身损伤机体健康，并透过血乳屏障存在于牛奶中[13]。据报道，每天暴露25 mg/kg的MCZ就会损伤狗的甲状腺功能[14]。

由于MCZ对环境和动物健康构成威胁，人们对MCZ毒性的认识正在逐步加强。据报道，氧化应激在MCZ毒理学中起重要作用[15]。CAT、SOD和GPX酶是构成抗氧化防御系统的第一道屏障[16]。研究表明，Keap1-Nrf2通路具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗衰老、抗细胞损伤、保护生育以及防止一些妇产科疾病的作用，它是调控细胞氧化应激水平的关键通路，该通路可调控多种靶基因的表达，包括Ⅱ相代谢酶基因和多种抗炎抗氧化基因，直接影响机体的氧化应激水平[17-18]。许多中药成分都具有抗氧化活性，如山药多糖(CYPS)、枸杞多糖(LBP)、黄芪多糖(APS)等[19]。已有大量研究发现，许多药物可激活或抑制Nrf2信号通路，其中包括中药及其有效成分，它们可减弱或防止氧化应激对正常细胞造成的损伤[20]。如有研究发现，APS可通过调节Keap1-Nrf2-ARE信号通路的表达，提高心肌的抗氧化能力，减少氧化应激[21]。

目前，关于MCZ氧化毒性的研究大多集中在一般的器官毒性，MCZ对雌激素的分泌干扰状况及机体的氧化损伤机制尚未得到深入研究，而且关于如何缓解MCZ毒性也鲜有报道。本研究分别从器官组织形态学水平、血液激素水平、组织激素受体及 Keap1-Nrf2调控基因转录水平这3方面探讨MCZ氧化损伤机理及中药多糖对MCZ毒性的缓解作用。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器MCZ(商品级Dithane-M45，80%)；LBP(80%)、APS(90%)、CYPS(30%)、菟丝子多糖(CCP，30%)和甘草多糖(GP，30%)均购自西安圣青生物科技有限公司；Go Taq®PCR Master Mix(A6001 Promega，USA)；Go ScriptTMReverse Transcription System (A5001，Promega，USA)；Eastep®Super总RNA提取试剂盒(LS1040，Promega，北京)；MDA、CAT、SOD试剂盒(南京建成)； ERα和ERβ试剂盒(酶联生物，上海)；引物(大连宝生物有限公司)。

1.2 实验动物分组与处理选用6周龄未经产的SPF级昆明小鼠，购自斯贝福(北京)实验动物科技有限公司，许可证号为SCXK(京)2019-0010。小鼠每日给予光照、黑暗各12 h，室内温度控制在(25.0±0.5)℃，湿度50%～60%。自由采食和饮水，适应性饲养1周后，将小鼠随机分为7组(A、B、C、D、E、F、G)，A组每天分2次灌服0.2 mL去离子水，B组分2次灌服100 mg/kg MCZ和0.2 mL去离子水，C、D、E、F和G组每天灌服100 mg/kg的MCZ及分别灌服200 mg/kg的LBP、APS、GP、CCP和CYPS。本研究中动物的使用经河北省动物保护协会批准，动物处理过程通过实验动物管理和使用委员会的动物伦理学审查。

1.3 指标测定

1.3.1小鼠脏器指数计算方法 称取小鼠体质量，处死后，剖开腹腔，取卵巢和子宫，除去多余脂肪后称质量。

卵巢指数=卵巢质量(mg)÷体质量(g)×100%

子宫指数=子宫质量(mg)÷体质量(g)×100%

1.3.2小鼠卵巢组织形态学观察 取出小鼠卵巢后固定在配置好的4%多聚甲醛溶液中，常规制备5 μm 石蜡组织切片，经苏木精-伊红(HE)在光学显微镜下进行观察。

1.3.3小鼠血清中CAT、SOD、MDA检测 小鼠眼球采血，血液经3 500 r/min离心，取上清。上清液分别用过氧化氢酶(CAT)试剂盒检测CAT活力、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测SOD活力和丙二醛(MDA)试剂盒检测MDA含量。

1.3.4小鼠血清中FSH、LH、E2含量检测 用1.3.3中所得上清液根据北京莱博泰瑞科技发展有限公司放射免疫法进行检测。

1.3.5小鼠卵巢中ERα和ERβ含量测定 将卵巢制备成10%组织匀浆，3 500 r/min离心后，吸取上清液，按照酶联生物科技有限公司(上海，中国)ELISA试剂盒说明书操作测定上清液中小鼠卵巢ERα和ERβ水平。

1.3.6小鼠卵巢中Keap1-Nrf2通路下游基因mRNA表达 根据总RNA提取试剂盒提取肝脏中的总RNA，将得到的RNA进行质量鉴定，发现其D260/D280值都为1.9～2.1，表明RNA纯度较高。然后用反转录试剂盒进行逆转录合成cDNA用于后续研究。采用Real-time PCR法对目的基因进行检测，引物由大连宝生物有限公司设计合成。循环参数：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个PCR循环。以GAPDH为内参，用2-△△Ct表示各目的基因的相对表达量。

表1 引物序列及扩增产物长度

2 结果

2.1 中药多糖对小鼠体质量和脏器指数的影响由表2数据可知，与空白对照组相比，MCZ处理组小鼠体质量极显著降低(P<0.01)，卵巢指数极显著上升(P<0.01)，子宫指数极显著上升(P<0.01)。与模型组(MCZ)相比，中药多糖处理组都能缓解MCZ毒性作用，但LBP处理组无显著性差异；APS组卵巢指数和子宫指数与MCZ组有极显著差异(P<0.01)；CCP组体质量和子宫指数与MCZ组差异显著(P<0.05)；CYPS组与MCZ组体质量和卵巢指数差异显著(P<0.05)，子宫指数差异极显著(P<0.01)；GP组与MCZ组体质量差异显著(P<0.05)，卵巢指数和子宫指数差异极显著(P<0.01)。综上所述，中药多糖能够缓解MCZ对小鼠的损伤，其中GP缓解效果较好。

2.2 小鼠卵巢组织学观察从图1可以看出，空白组成年小鼠卵巢内可以看到一定数量结构完整、界限清晰、依次排列的成熟卵泡。MCZ处理组小鼠卵巢内，卵泡数量减少、界限模糊、结构遭到破坏。经LBP、APS、GP、CCP和CYPS治疗后，MCZ对卵巢的损伤有所恢复，如卵巢内卵泡较MCZ组增多，APS、GP、CCP和CYPS治疗后卵泡间有相对清晰的界限；但与空白组相比，卵泡界限不够清晰、成熟卵泡数量较少。综上，MCZ处理，能够对小鼠卵巢造成损伤，减少成熟卵泡数量，LBP、APS、GP、CCP和CYPS能够缓解MCZ对卵巢的损伤作用。

表2 处理组小鼠体质量、卵巢指数和子宫指数

A.空白对照组；B.MCZ组；C.LBP组；D.APS组；E.GP组；F.CCP组；G.CPPS组

2.3 中药多糖对血清中CAT、SOD、MDA的影响如图2所示，与空白对照组相比，MCZ处理组CAT活力和MDA含量显著降低(P<0.05)，SOD活力极显著降低(P<0.01)。与MCZ组相比，LBP、APS和CCP处理组CAT活力极显著升高(P<0.01)，GP组显著升高(P<0.05)，且与空白组无显著性差异。LBP和GP组SOD活力较MCZ组极显著升高(P<0.01)，与空白组无统计学差异。APS组与MCZ组相比SOD活力显著升高(P<0.05)，但与空白组差异显著(P<0.05)。GP组MDA含量比MCZ组极显著升高(P<0.01)，与空白组无显著性差异。LBP、APS、CCP和CYPS组与MCZ组MDA含量无显著性差异；与空白组相比，APS和CCP组MDA含量差异极显著(P<0.01)，CYPS组差异显著(P<0.05)。因此，GP能够较好得缓解MCZ对CAT、SOD和MDA的影响。

2.4 中药多糖对血清中FSH、LH、E2含量的影响如图3所示，与空白组相比，MCZ和CYPS组FSH含量显著降低(P<0.05)，LBP和GP组极显著降低(P<0.01)，APS和CCP组与空白组无显著性差异；与MCZ组相比，APS组FSH含量极显著升高(P<0.01)，其他中药多糖组无显著性差异。与空白组相比，MCZ和CCP组LH含量极显著降低(P<0.01)，CYPS组显著降低(P<0.05)；与MCZ组相比，LBP和APS组FSH含量极显著升高(P<0.01)，GP和CYPS组显著升高(P<0.05)。与空白组相比，MCZ和CYPS组E2含量显著升高(P<0.05)，LBP和APS组极显著升高(P<0.01)；与MCZ组相比，APS组极显著升高(P<0.01)，CCP组极显著降低(P<0.01)。

图2 中药多糖对血清中CAT、SOD、MDA的影响

图3 中药多糖对血清中FSH、LH、E2的影响

2.5 中药多糖对卵巢中ERα和ERβ含量的影响从图4可以看出，与空白组相比，MCZ能够极显著降低ERα含量(P<0.01)，并显著降低ERβ含量(P<0.05)。与MCZ组相比，LBP、CCP和CYPS组ERα含量极显著升高(P<0.01)，GP组ERα含量显著升高(P<0.05)，APS组无统计学差异；与空白组相比，CCP组ERα含量极显著(P<0.01)升高，LBP组显著(P<0.05)升高，其他组无显著性差异。与MCZ组相比，LBP和GP组ERβ含量显著(P<0.05)升高，CCP和CYPS组ERβ含量极显著(P<0.01)升高，APS组无显著性差异；且与空白组都无显著性差异。综上所述，GP和CYPS缓解可MCZ对卵巢中ERα和ERβ含量的影响。

图4 中药多糖对卵巢中ERα和ERβ的影响

2.6 中药多糖对卵巢中Keap1-Nrf2通路下游基因mRNA表达的影响由图5可知，与空白组相比，MCZ处理组显著降低HO-1、NQO1、Gstt2和GcLc mRNA的表达量(P<0.05)，显著升高Gpx2 mRNA的表达量(P<0.05)。与MCZ组比较，LBP处理极显著升高HO-1 mRNA的表达量(P<0.01)，GP处理显著升高HO-1 mRNA的表达(P<0.05)；LBP极显著降低Gpx2 mRNA的表达量(P<0.01)，APS和GP显著降低Gpx2 mRNA的表达(P<0.05)；LBP、APS和GP显著升高NQO1 mRNA的表达(P<0.05)；GP极显著升高Gstt2 mRNA的表达(P<0.01)，CYPS显著升高Gstt2 mRNA的表达(P<0.05)；GP显著升高GcLc mRNA的表达(P<0.05)。综上所述，GP可以较好地逆转MCZ对卵巢中Keap1-Nrf2通路下游基因mRNA表达的影响。

图5 中药多糖对卵巢中Keap1-Nrf2通路下游基因mRNA表达影响

3 讨论

大量文献研究表明，MCZ在全球范围内的广泛应用导致成年动物每天暴露在500～1 500 mg/kg MCZ的时间较长[22]。而关于MCZ毒性的研究表明，当小鼠暴露在100 mg/kg MCZ时能够引起小鼠损伤。因此本试验通过口服灌胃的方法建立MCZ暴露损伤模型，探究能够缓解MCZ毒性的中药多糖。

WHO已经将MCZ归类为二级或剧毒化学物质，几项研究都表明，暴露MCZ及其主要代谢物ETU与各种健康问题有关，包括癌症、内分泌失调和生殖障碍等[23-24]。BALIGAR等[25]研究发现，MCZ处理组较空白组大鼠体质量减轻，本试验证明MCZ可以降低小鼠体质量，而GP、CCP和CYPS治疗逆转了MCZ对小鼠体质量的影响。本研究还发现MCZ处理增加了小鼠卵巢指数和子宫指数，其中APS、CYPS和GP治疗可以有效降低卵巢指数和子宫指数，卵巢组织学观察发现，暴露MCZ的小鼠健康卵泡数目减少。有研究表明，暴露MCZ导致大鼠闭锁卵泡数量增加，健康卵泡数减少，黄体数量减少[26],与本研究结果一致。说明MCZ可能通过损伤卵巢和子宫引起生殖障碍，而中药多糖可以逆转MCZ的这种影响。FSH、LH和E2的正常水平是影响卵巢正常发育和排卵的重要因素[27]。本研究用放射免疫法检测血清中FSH、LH和E2的含量，结果发现MCZ处理降低FSH和LH的含量，提高E2含量，MCZ可能通过引起内分泌紊乱影响下丘脑-垂体-性腺轴[26]。但中药多糖缓解MCZ对下丘脑-垂体-性腺轴损伤的效果并不理想。ERα和ERβ是维持卵巢颗粒细胞分化、卵泡和卵母细胞生长发育和排卵功能的关键受体[28-29]。本研究检测卵巢中ERα和ERβ发现，MCZ降低ERα和ERβ在卵巢中的表达，而LBP、GP、CCP和CYPS逆转了MCZ的这种影响。综上，MCZ能够引起生殖损伤，而中药多糖可以缓解MCZ的损伤作用。

有研究认为，MCZ作为氧化应激源，通过诱导自由基的形成引起机体氧化应激[30]。CAT、SOD和GPX酶是构成抗氧化防御系统的第一道屏障[31]。本研究检测小鼠血清中CAT和SOD活力以及MDA含量，发现MCZ能够降低CAT和SOD活力和MDA含量。GIRISH等[32]发现MCZ诱导大鼠SOD、CAT活性降低。KAYHAN等[33]研究证实MCZ诱导斑马鱼心脏组织中MDA含量和CAT活性降低。这说明MCZ能够作为氧化应激原引起氧化应激。大量研究发现，LBP[34]、APS[35]、GP[36]、CCP和CYPS[37]具有抗氧化作用。本研究结果也发现，以上几种多糖可以逆转MCZ降低的CAT和SOD活力及MDA含量来对抗氧化应激，其中GP较其他几种多糖治疗效果最好。

当机体暴露于外源性毒物和氧化剂(例如重金属、异种生物、自由基和药物)会引起氧化应激，其特征在于活性氧(ROS)水平高于正常生理水平状态[38]。当机体出现氧化还原失衡时，Nrf2与Keap1分离，转移到细胞核中，并与小的Maf蛋白结合，并与位于细胞保护性基因启动子区域的抗氧化反应元件(ARE)结合以激活其转录[39]。Nrf2调控的基因包括细胞内氧化还原平衡蛋白(如:γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，γ-GCS)和Ⅱ期解毒酶[(如:NAD(P)H：醌氧化还原酶1(NQO1)]，能够维持细胞的氧化还原能力并促进有毒物质的排泄[40]。本研究发现，MCZ下调Keap1-Nrf2通路下游基因HO-1、NQO1、GcLc和Gstt2表达，上调Gpx2表达。而较MCZ组，LBP上调HO-1、NQO1、GcLc和Gstt2表达。QI 等[41]发现，LBP可以干预Keap1-Nrf2通路，上调HO-1、NQO1 mRNA表达。另外，本研究还发现GP能够较好地逆转MCZ对Keap1-Nrf2通路下游基因表达的影响。说明MCZ通过Keap1-Nrf2通路对小鼠造成损伤，而GP可以干预Keap1-Nrf2通路缓解MCZ对小鼠的损伤作用。

暴露MCZ可引起小鼠氧化应激，降低CAT和SOD活力及MDA含量，损伤小鼠卵巢，干预Keap1-Nrf2通路下游基因的表达，还可以扰乱雌激素和雌激素受体的表达，而LBP、APS、CCP、CYPS和GP可在一定程度上缓解MCZ对小鼠的毒性，其中GP的效果最好。