鸭疫里默氏杆菌三磷酸甘油醛脱氢酶与鸭血浆蛋白的结合作用

高继业，彭俊杰，耿淑炎，黄 伟，黎容红，李德龙，陈思怀

(1.西南大学 动物医学院，重庆 402460；2.西南大学 医学研究院免疫学研究中心，重庆 402460；3.重庆更尚科技有限公司，重庆 402460)

鸭疫里默杆菌(Riemerellaanatipestifer，R.anatipestifer)可感染鸭、鹅、火鸡及其他鸟类等多种动物，出现全身浆膜的纤维素性渗出，产生肝周炎、心包炎和气囊炎等特征性病理变化[1]。R.anatipestifer血清型的多样性和不断增强的耐药性使之成为当前危害我国养鸭业最为严重的病原之一[2-5]。尽管关于R.anatipestifer的研究报道很多，但主要是全基因组和致病因子方面的研究。其中，GenBank登录的R.anatipestifer全基因组序列多达33个以上，致病因子包括三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G-APDH)、协同溶血素(CAMP)、毒力相关蛋白(VapD)、外膜蛋白(OmpA)、明胶酶、载铁体相互作用蛋白和铁依赖抑制因子等[6-14]。尽管如此，关于R.anatipestifer导致感染鸭发生急性炎性渗出反应的可能机制尚未见报道。

纤溶酶原是纤维蛋白溶解酶的无活性前体，可被组织型纤溶酶原激活物、尿激酶型纤溶酶原激活物以及激肽释放酶和凝血酶等激活，溶解血液中的血纤维蛋白，进而发挥抗凝血效应[15]。另外，纤维蛋白原是血纤维蛋白的前体，被凝血酶激活后参与完成血液的凝固过程。当动物血液中纤溶酶原和纤维蛋白原水平发生异常时，血液的凝固/纤溶系统机能可能会发生紊乱，进而促发急性或进行性炎性渗出反应。目前关于鸭血液凝固/纤溶系统还知之甚少，是否也存在与哺乳动物相似的纤溶酶原或纤维蛋白原尚需证实。

前期研究发现，R.anatipestifer能产生具有酶活性的GAPDH同源体RaGAPDH，此同源体与恶性疟原虫的GAPDH具有相似的生物学功能，能与人源和兔源纤溶酶原和纤维蛋白原发生结合[14]。但RaGAPDH能否与鸭血液凝固/纤溶系统中的物质发生相互作用，能否对鸭血液循环系统的凝固/纤溶机能产生不利影响，都还需要进一步证实。为此，本研究拟对R.anatipestifer感染鸭的血浆蛋白进行比较分析，并采用Dot-ELISA、Western blot和质谱技术分析可能与RaGAPDH发生结合的血浆蛋白成分，期望通过本研究探讨引发R.anatipestifer感染鸭发生炎性渗出反应的分子基础及可能机制，为阐明R.anatipestifer感染致病的分子机理奠定基础，对预防与控制R.anatipestifer感染具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 菌株R.anatipestifer血清Ⅰ型、Ⅱ型菌株SC、AF均由本研究室分离、鉴定冻干保存；重组表达菌BL21(pET-28a+-gap)由本研究室构建、保存。

1.2 主要试剂胰蛋白胨大豆肉汤(trypticase soybean broth，TSB)、胰蛋白胨大豆琼脂(trypticase soy agar，TSA)为OXOID公司产品；丙烯酰胺、β-巯基乙醇、TEMED、过硫酸铵、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250和Western blot试剂盒为上海生工生物工程公司产品；IPTG、氨苄青霉素、卡拉霉素为重庆鼎国生物试剂有限公司产品；改良Bradford蛋白定量试剂盒为Vazyme公司产品；蛋白纯化试剂盒BeaverBeadsTMIDA-Ni为宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.3 实验动物及R.anatipestifer感染模型的建立取R.anatipestiferAF株、SC株冻干菌种，划线接种于TSA平板；挑取平板上长出的单个菌落接种到TSB肉汤，以160 r/min 37℃空气浴振荡培养至对数生长期中期,调节菌体浓度至109CFU/mL备用。1日龄非免健康四川麻鸭(购自重庆天彬禽苗孵化场)在生物隔离器内模拟实际给予光照及充足饮水和饲料，饲养至20日龄行腿部肌肉注射方式分别接种预先准备好的菌悬液(0.4 mL/只)；待被接种鸭出现明显发病症状，经病原学鉴定无误后无菌采集抗凝血，分离血浆分装后置于-20℃下保存备用。同时设注射TSB非感染组作为对照组。

1.4 感染鸭血浆蛋白SDS-PAGE分析及质谱鉴定取感染组、非感染组动物血浆，经改良Bradford法进行血浆总蛋白定量后以0.15 mol/L PBS(pH 7.2)作适当稀释；参照《分子克隆实验指南》进行SDS-PAGE电泳分析(分离胶、浓缩胶浓度分别为10%、5%)。切下2组动物血浆蛋白差异条带，低温保存送至上海生工生物工程公司作质谱鉴定。

1.5 重组RaGAPDH的分离纯化及多克隆抗体的制备取参考文献[14]中构建的重组表达菌E.coliBL21(含重组质粒pET-28a+-gap)，经0.5 mmol/L IPTG、37℃下诱导3 h后获得可溶性重组RaGAPDH。重组RaGAPDH经BeaverBeadsTMIDA-Ni颗粒纯化、SDS-PAGE分析后采用改良Bradford法进行蛋白定量分析，同时送至上海生工做蛋白质质谱鉴定，并对重组RaGAPDH酶活性进行鉴定。

取适量重组RaGAPDH与弗氏佐剂混合制成免疫抗原，按常规免疫程序接种健康青年大耳白兔，基础免疫后加强免疫2次。于最后1次免疫7 d后无菌采血，分离血清，经双向琼脂扩散试验测定其效价后分装低温保存备用。

1.6 重组RaGAPDH与鸭血浆蛋白成分作用的Dot-ELISA分析采用Dot-ELISA法对重组RaGAPDH与健康鸭血浆蛋白成分的结合作用进行分析，具体程序如下：取1 μL作适当稀释的健康鸭血浆滴于1 cm2的PVDF膜上，经37℃孵育30 min后以0.15 mol/L PBS(pH 7.2)洗涤3次，除去未吸附的血浆蛋白；将PVDF膜用TBS(含5%脱脂奶粉)封闭过夜后与纯化的重组RaGAPDH蛋白溶液(10 mg/L)室温孵育1 h，再用TBST(含0.05%吐温-20)缓冲液洗涤去除未结合的重组蛋白；将洗涤后的PVDF膜置含兔抗重组RaGAPDH多克隆抗体的封闭液中，室温孵育1 h；以同样的TBST洗涤3次，与HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶4 000稀释)于室温下孵育1 h，经TBST洗涤3次后以DAB显色。同时设立不包被血浆蛋白的阴性对照和仅包被重组RaGAPDH阳性对照。

1.7 重组RaGAPDH与鸭血浆蛋白成分结合作用的Western blot分析取保存备用的血浆，经适当稀释后进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕后取下凝胶，参照试剂盒说明书进行Western blot，分析重组RaGAPDH与鸭血浆蛋白成分的结合作用情况。

2 结果

2.1 重组RaGAPDH的表达与纯化取经诱导的重组表达菌BL21(pET-28a+-gap)进行SDS-PAGE分析,图谱显示：gap基因获得可溶性表达，蛋白相对分子质量约为36.7 kDa(图1)，与预期大小相符。

A.重组蛋白表达(1.IPTG诱导的重组菌裂解上清；2.未经IPTG诱导的重组菌；3.IPTG诱导的重菌);B.重组蛋白表达(1.BeaverBeadsTM IDA-Ni纯化的重组RaGAPDH；M.蛋白Marker)

纯化的重组蛋白进行质谱鉴定和定量分析，结果显示，获得的蛋重组蛋白为RaGAPDH，含量为1.46 g/L(图2)。纯化产物与弗氏佐剂混合后免疫大白兔，获得的多克隆抗体效价为1∶128。

图2 重组RaGAPDH质谱分析

2.2 重组RaGAPDH与鸭血浆蛋白成分结合作用Dot-ELISA分析健康鸭血浆包被到PVDF膜后，再分别与重组RaGAPDH、兔抗重组RaGAPDH多克隆抗体(琼扩效价1∶16)及HRP标记羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育、DAB显色，结果显示，试验组和阳性对照组的显色反应均呈阳性，阴性对照组1和2的显色反应均呈阴性(表1，图3)。

表1 重组RaGAPDH与鸭血浆蛋白作用Dot-ELISA分析

A.试验组；B.阳性对照1；C.阴性对照1；D.阴性对照2

2.3 重组RaGAPDH与鸭血浆蛋白作用Western blot分析及质谱鉴定健康鸭血浆蛋白经SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜，分别与重组RaGAPDH、一抗、HRP标记二抗进行孵育、显色，结果显示，在97.2，66.4 kDa附近的2条蛋白条带与重组RaGAPDH的作用呈阳性(图4)。切下阳性反应蛋白条带，低温保存送至上海生工生物工程公司进行质谱鉴定，分别为纤溶酶原和富含组氨酸糖蛋白。

2.4R.anatipestifer感染动物血浆蛋白的SDS-PAGE分析及质谱鉴定取感染鸭血浆，经蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳分析。电泳图谱显示，AF、SC菌株感染组均与非感染对照组间存在5条差异蛋白条带，分别命名为U1、U2、U3、U4、D1(表2,图5)。利用Quantity One软件对电泳图谱上差异蛋白条带进行灰度分析，2个感染组U1、U2、U3、U4蛋白条带含量较对照组显著升高(P<0.01)，D1蛋白条带含量较对照组显著降低(P<0.05)，AF、SC菌株感染组间的蛋白条带差异不显著(P>0.05)。

A.纤溶酶原;B.富含组氨酸糖蛋白;1.重组RaGAPDH；2.一抗；3.HRP标记二抗；M.蛋白Marker

将5条差异显著蛋白条带U1、U2、U3、U4、D1分别回收后送上海生工生物工程公司进行质谱分析(表2)。结果显示，U1为α2-M或血浆铜蓝蛋白，U2为补体3d(C3d)，U3为α-1-酸性类糖蛋白、纤维蛋白原-α链，U4可能为α-1-酸性类糖蛋白，D1为富含组氨酸糖蛋白。

A.AF感染组；S.SC感染组；N.对照组；U1～U4.差异蛋白条带U1、U2、U3、U4灰度分析；D1.差异蛋白条带D1灰度分析

表2 感染鸭血浆差异蛋白的质谱分析

3 讨论

3.1 RaGAPDH可能引发鸭血液抗凝血能力下降R.anatipestifer能产生和分泌具有酶活性的GAPDH同源体RaGAPDH，该同源体能与人源和兔源纤溶酶原和纤维蛋白原发生结合，据此推测RaGAPDH可能参与动物血液循环系统机能紊乱过程[14]。为此，本研究采用Dot-ELISA和Western blot方法研究重组RaGAPDH与鸭血浆蛋白的相互作用，可能对鸭血液凝固/纤溶系统机能产生的影响。Dot-ELISA和Western blot研究结果显示，RaGAPDH可与鸭血浆蛋白发生结合作用，经质谱分析发现其主要成分为纤溶酶原和HRG。血纤溶酶是动物血液循环系统中保障血液凝固/纤溶系统机能正常发挥的重要成员，可被组织型纤溶酶原激活物、尿激酶型纤溶酶原激活物、FⅫa以及激肽释放酶和凝血酶等激活，溶解血纤维蛋白，发挥抗凝血效应[15]。本研究中RaGAPDH与纤溶酶原结合，可能会抑制纤溶酶原激活，无法发挥溶解血纤维蛋白的生物学效应，致使血液中纤维蛋白/(原)含量增高，血液凝固/纤溶系统平衡被打破，凝血机能亢进，血液循环障碍。结合黎德兵等[16]对雏鸭感染R.anatipestifer的病理学研究发现感染鸭实质器官出现严重肿大和弥漫性充血，故推测RaGAPDH与纤溶酶原的结合致动物血液纤溶系统的抗凝血机能下降，血液循环发生障碍。另外，HRG是一种富含组氨酸的多功能活性蛋白，可与肝素、纤溶酶(原)、纤维蛋白(原)、血小板和单核细胞发生结合，对血液凝固系统与纤溶系统发挥重要的调节作用。RaGAPDH对鸭HRG的结合必然导致鸭血液凝固/纤溶系统的调节能力下降，平衡极易被打破。综上所述，RaGAPDH可与鸭血浆蛋中的纤溶酶原和HRG发生结合，这种结合可能导致鸭血液纤溶系统的抗凝血能力下降。

3.2R.anatipestifer感染导致动物血液凝固/纤溶系统平衡能力下降α2-M是存在于正常人体、鸟类、爬行类及两栖类动物的血液和其他组织内的一种非特异性蛋白酶抑制剂，主要由肝细胞合成并分泌。血液中的α2-M可与血纤维蛋白溶解酶和凝血酶发生不可逆结合，发挥促凝血或抗凝血作用，进而参与凝血平衡、纤溶激肽系统调节等一系列生理及病理过程[17-19]。研究结果显示，R.anatipestifer感染鸭血浆α2-M含量水平显著增高，表明R.anatipestifer感染导致动物血液凝固/纤溶系统的平衡能力下降。另外，R.anatipestifer感染还导致了鸭血浆中HRG含量显著下降，是否因其表达分泌的RaGAPDH与之结合有关还有待进一步研究证实，但是血浆HRG含量的显著下降必然也会导致动物血液凝固/纤溶系统的平衡调节能力下降。

3.3R.anatipestifer感染引发动物肝脏急性炎性反应和严重损伤α1-AG主要是由肝脏巨噬细胞和粒细胞合成并分泌的一种十分稳定的急性时相蛋白。在正常情况下，动物血浆中的含量较低，当处在急性感染、炎症等病理状态下，α1-AG水平会升高[20]。因此，人医临床上常将α1-AG作为急性细菌感染的标志和肝病检测的重要指标，且其含量水平与肝病变的范围和损害程度明显相关。本研究中感染鸭血浆α1-AG含量显著增高，据此进一步证实R.anatipestifer感染会引发动物肝脏发生急性炎性反应和严重损伤。

综上所述，重组RaGAPDH可与鸭血浆中的纤溶酶原和HRG发生结合，R.anatipestifer感染鸭血浆α2-M和α1-AG含量显著增高(P<0.05),HRG含量显著下降(P<0.05)。研究结果表明，R.anatipestifer产生的具有酶活性的GAPDH同源体RaGAPDH能与动物血浆纤溶酶原和HRG发生结合，这种结合可能导致其血液凝固系统/纤溶系统的平衡出现紊乱和抗凝血机能下降；R.anatipestifer感染可引发动物肝脏急性炎性反应和严重损伤，及血浆α2-M、α1-酸性糖蛋白含量的显著增高和HRG含量的显著下降(P<0.05)，可能导致动物血液凝固系统/纤溶系统平衡的自我调节能力下降，但能否引发动物弥漫性血管内凝血和微血栓的形成，以及R.anatipestifer感染引发的HRG含量水平显著下降是否与其分泌表达的RaGAPDH有关，还有待进一步研究证实。