渐狭叶烟草组培苗生根条件优化及在基因转化中的应用

赵陆滟，李荣平，吴劲松

(中国科学院昆明植物研究所/云南省野生资源植物研发重点实验室，云南 昆明 650201)

栽培烟草(Nicotiana tabacum)是我国最重要的经济作物之一，但它是四倍体，较大的基因组极大地阻碍了其与昆虫或微生物互作的研究。渐狭叶烟草(N.attenuata)是一种二倍体的野生烟草，原产于美洲，因其基因组较小、生活周期较短，近些年来逐渐成为烟草属植物中研究植物与昆虫、植物与病原菌互作的模式植物[1—3]。

链格孢菌(Alternaria alternata)是一种营腐生性生活的病原真菌，其不同病理小种可以侵染烟草、玉米(Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、苹果(Malus pumila)、梨(Pyrus spp.)等诸多重要农作物，每年均造成大量的经济损失[4]。链格孢菌在栽培烟草上导致的病害为烟草赤星病，但目前对植物抵御这种病原菌的防御反应研究较少。

近年来，以渐狭叶烟草为模式的研究发现，链格孢菌感染后，植物会产生非常复杂的防御反应，包括植物激素茉莉酸、乙烯和脱落酸信号的激活，植物保护素东莨菪素和椒二醇的生物合成等[1,5—8]。虽然渐狭叶烟草是研究烟草属植物和链格孢菌互作的良好模式，但是研究中发现，渐狭叶烟草在转基因过程中组培苗生根非常困难，这极大阻碍了它做为一个模式植物在分子生物学研究中的应用。如果能优化条件，让转基因组培苗快速生根，不仅可以高效率、低成本地获得转基因苗，还会极大加快抗病等研究工作。

不同植物组培苗的生根实验发现，不同浓度的植物激素、嘧啶醇及活性炭等可以起到不同的作用。喻娜[9]在研究旱半夏(Pinellia ternata)组培苗生根发现，低浓度NAA利于生根，IBA处理的整体效果较好，活性炭能较明显地促进组培苗根伸长，使根更粗壮；文清岚等[10]在研究杉木(Cunninghamia lanceolata)组培苗生根时发现，IAA和 NAA浓度均以 0.8 mg·L-1诱导生根最好，但IAA比NAA效果更好；孙会兵等[11]对孟士德薰衣草(Lavandula angustifolia)组培苗生根的研究表明，生根培养基加入0.5 mg·L-1CCC能显著提高生根率，生根试管苗移栽成活率也较高；蒋小满等[12]在矮生一品红(Euphorbia pulcherrima)组培苗的生根诱导研究中发现，100 mg·L-1生根粉能使组培苗生根率达到76.3%；杨海萍等[13]在影响芦笋(Asparagus officinalis)离体快繁关键因子的研究中发现，生根培养基中添加1.0 mg·L-1嘧啶醇可显著提高生根率；陈雄伟等[14]对鼎湖山紫背天葵(Begonia fimbritipula)组培苗生根研究发现，添加300 mg·L-1活性炭明显提高生根质量并抑制细芽点分化。

为此，本实验先以渐狭叶烟草组培苗为材料，进行不同浓度 IBA、NAA、IAA、嘧啶醇、CCC、生根粉及活性炭对组培苗生根影响的研究，并利用优化的结果测试其对转基因组培苗生根的影响，最终获得对转基因组培苗有良好生根效果的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

渐狭叶烟草是一种原产于北美的二倍体野生烟草，为栽培烟草的野生近缘种。在实验室自交繁殖31代后用于实验。渐狭叶烟草种子的萌发和生长实验参考 Krügel等方法[15]。

1.2 再生苗培养条件

渐狭叶烟草转化和组培过程参考 Krügel等[15]，以1/4 MS替代Peter’s Hydro-Sol为生根基础培养基，添加并配制 NAA、IBA、IAA、生根粉、嘧啶醇或CCC 浓度为 0、0.4 mg·L-1、0.8 mg·L-1、1.2 mg·L-1、1.6 mg·L-1、2.0 mg·L-1的培养基；活性炭浓度为 0、0.4 g·L-1、0.8 g·L-1、1.2 g·L-1、1.6 g·L-1、2.0 g·L-1的培养基。琼脂 7.0 g·L-1，pH 调至 6.0，0.12 MPa，121 ℃，灭菌20 min。其中除活性炭灭菌前加入，其余生长调节剂、生根粉及嘧啶醇等先配制母液过滤灭菌后，待培养基灭菌后温度降至60 ℃再加入。培养温度(25±2) ℃，连续光照 12 h·d-1，光照强度2000 lx。取愈伤上生长至2～3 cm的渐狭叶组培苗，切干净下部愈伤，接种至上述生根培养基中，每组接种6瓶，每瓶接种2～3株，接种后每天观察组培苗生根情况，统计组培苗的生根数、生根率，观察根及地上部分生长情况。

1.3 转基因再生苗培养条件

以1/4MS+0.8 mg·L-1IBA为转基因再生苗生根培养基，添加琼脂7.0 g·L-1，pH调至6.0，121 ℃高压灭菌20 min。培养温度(25±2) ℃，连续光照12 h·d-1，光照强度 2000 lx。取转化了 NaERF1-like或NaMYB44-like RNAi载体的愈伤上生长至2～3 cm的渐狭叶烟草再生苗，切干净下部愈伤，接种至生根培养基中，每组接种6瓶，每瓶接种2～3株，接种后统计20 d内组培苗的生根数、生根率；对未生根部分转基因再生苗进行继代，并去除下部新长出愈伤后接种至新的生根培养基，再次统计40 d后所有组培苗的生根数、生根率，观察根及地上部分生长情况。生根后移栽，待根系生长健壮后，将生根的组培苗用镊子从培养基中取出，洗去培养基，移栽至38 cm吸湿育苗块中炼苗2～3周，待根系大部分长出育苗块后，移栽至育苗袋中，放于(25±2) ℃玻璃温室内培养。

1.4 数据统计与分析

生根率(%)=组培苗生根数/组培苗接种数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同浓度外源添加物对组培苗生根的影响

2.1.1 NAA

渐狭叶烟草组培苗接种至含有不同浓度 NAA的1/4MS培养基中，90 d内的生根情况如图1。结果表明，对照处理在整个统计过程中均不能生根，但是不同浓度NAA处理均能明显诱导组培苗生根；NAA处理19 d后组培苗开始出现明显的根，处理51 d后生根率超过75%，最高可达100%。虽然NAA处理可以较好地诱导生根，但是苗的根及地上部分生长均受到明显的抑制，且随着NAA浓度升高抑制作用逐渐增大。

图1 不同浓度NAA对组培苗生根率的影响Fig.1 Effects of different NAA concentrations on rooting rate of tissue-cultured seedlings

2.1.2 IBA

图2显示，与对照(0 mg·L-1)比较，不同浓度IBA处理90 d后均能明显诱导渐狭叶烟草组培苗生根，其中效果最佳的是 0.8 mg·L-1IBA处理，该处理在35 d后生根率可达72.72%。值得一提的是，不同浓度IBA处理不仅可以诱导组培苗生根，而且苗的根及地上部分生长均正常(图2)。

图2 不同浓度IBA对组培苗生根的影响Fig.2 Effect of different concentrations of IBA on rooting of tissue-cultured seedlings

2.1.3 生根粉

统计处理90 d后组培苗生根情况(图3)，与对照(0 mg·L-1)比较，不同浓度生根粉处理均能明显诱导组培苗生根，其中诱导生根效果最好的是 2 mg·L-1生根粉处理，该处理在48 d后生根效率可达75%，说明2 mg·L-1生根粉诱导生根效果最好，但苗的根及地上部分生长均受到明显抑制，故不推荐使用。而 0.8 mg·L-1生根粉诱导的苗的根及地上部分生长正常，在19 d后生根率达50%。

图3 不同浓度生根粉对组培苗生根率的影响Fig.3 Effect of different concentrations of root powder on rooting rate of tissue-cultured seedlings

2.1.4 活性炭

渐狭叶烟草组培苗接种至含有不同浓度活性炭的1/4MS培养基中，90 d后均能不同程度地诱导生根，其中0.8 mg·L-1活性炭处理的组培苗10 d后开始长根(图4)，60 d时生根率达到最高(53.85%)，且苗的根及地上部分生长均正常。

图4 不同浓度活性炭对组培苗生根率的影响Fig.4 Effects of different concentrations of activated carbon on rooting rate of tissue-cultured seedlings

2.1.5 IAA

实验表明，不同浓度的IAA对渐狭叶烟草组培苗生根的影响不同(图5)。不同浓度IAA处理与对照(0 mg·L-1)比较，除1.6 mg·L-1IAA处理外，其他浓度IAA均能诱导组培苗生根，但诱导效果比IBA差，其中生根率最高的是1.2 mg·L-1IAA处理，生根率为33.33%。说明0.4、0.8、1.2和2.0 mg·L-1IAA均能诱导组培苗生根，但是与IBA相比诱导效果较差，但其根及地上部分生长均正常。

图5 不同浓度IAA对组培苗生根率的影响Fig.5 Effects of different concentrations of IAA on rooting rate of tissue-cultured seedlings

2.1.6嘧啶醇

由图6可见，不同浓度嘧啶醇对渐狭叶烟草组培苗生根的影响不同。不同浓度嘧啶醇处理与对照(0 mg·L-1)比较，均能部分诱导组培苗生根，但诱导效果不明显，其中1.6 mg·L-1处理21 d开始长根，26 d达到生根最大值，生根率为33.33%，其根及地上部分生长均正常。

图6 不同浓度嘧啶醇对组培苗生根率的影响Fig.6 Effects of different concentrations of pyrimidine on the rooting rate of tissue-cultured seedlings

2.1.7 CCC

取愈伤上生长至2～3 cm的渐狭叶烟草组培苗，切干净下部愈伤，接种于含有不同浓度 CCC的1/4MS培养基中，不同浓度的CCC对其生根的影响不同(图7)。 结果表明，不同浓度CCC处理与对照(0 mg·L-1)比较，均不能显著诱导组培苗生根。

图7 不同浓度CCC对组培苗生根率的影响Fig.7 Effects of different concentrations of CCC on rooting rate of tissue-cultured seedlings

2.2 IBA在渐狭叶烟草转基因组培苗生根中的应用

从上述结果可以看出，0.8 mg·L-1IBA处理不仅可以使组培苗达到较高的生根率，而且对苗的根及地上部分生长均不会造成不良影响。为此，我们将该处理应用于转基因组培苗的生根实验(图8、图9)。

图8 IBA处理对渐狭叶烟草转基因组培苗生根率的影响Fig.8 Effects of IBA on the rooting rate of transgenic tissue-cultured plantlets of Nicotiana attenuata

图9 渐狭叶烟草转NaERF1-like RNAi载体组培苗生根及移栽表型Fig.9 Rooting and transplanting phenotype of transgenic NaERF1-like RNAi tissue-cultured plantlets of Nicotiana attenuata

构建NaERF1-like和NaMYB44-like 的RNAi载体，利用农杆菌分别进行渐狭叶烟草的稳定转化。当抗生素筛选培养基中新生愈伤上长出2～3 cm渐狭叶烟草再生小苗，切干净下部愈伤，接种于含有1/4MS+0.8 mg·L-1IBA 培养基中。结果表明，没有IBA处理的情况下，转基因组培苗在90 d内生根率为0；而0.8 mg·L-1IBA处理极大提高了转基因组培苗的生根率，20 d后NaERF1-like和NaMYB44-like组培苗的生根率分别达66.67%和58.33%；对于20 d内没有生根的转基因组培苗再切去下部愈伤处理，并继代至1/4MS+0.8 mg·L-1IBA培养基中，再培养20 d，NaERF1-like转基因苗总的生根率可达95%，NaMYB44-like转基因苗生根率达90%。

后期实验发现，1/4MS+0.8 mg·L-1IBA培养基也适用于实验室其他基因转化的组培苗生根，且均达到较好的生根效果。

3 讨论

近年来，渐狭叶烟草作为烟草属的一种模式植物，广泛应用于植物与昆虫、植物与链格孢菌互作的研究。但是，在转基因过程中其组培苗生根困难的问题(常有组培继代 1年不生根)极大地限制了它作为模式植物在研究中的作用。遗憾的是，目前尚无促进渐狭叶烟草组培苗生根的报道。

虽然渐狭叶烟草组培苗生根技术仍处于摸索阶段，但在栽培烟草及其他植物中已有相关研究[16—20]。在植物组织培养过程中，不定芽生根培养受诸多因素影响，培养基是关键因素之一[21]。而植物组织培养中器官分化的关键因素是生长调节剂，如 NAA、IBA、IAA、嘧啶醇、CCC、生根粉等常用于诱导植物组培苗根的分化[9,13,16,22—24]，活性炭在诱导生根过程中同样起着重要的作用[14]。

本研究先以渐狭叶烟草组培苗为材料，测试不同浓度 NAA、IBA、IAA、嘧啶醇、CCC、生根粉及活性炭等外源添加物对组培苗生根的影响。结果表明，不同浓度NAA处理均能明显诱导组培苗生根，但根的伸长及地上部分生长均受到抑制，且随着浓度升高影响逐渐变大，该结果与在旱半夏[9]和金线莲(Anoectochilus roxburghii)[25]中的研究结果一致，产生不良影响的原因可能与外植体产生乙烯等有害物质有关。

IBA和生根粉浓度均以0.8 mg·L-1诱导生根最好，且根及地上部分生长均良好，但IBA比生根粉诱导效果更好，生根率达72.73%，IBA和生根粉均可以诱导渐狭叶烟草生根，与旱半夏[9]和梭梭(Haloxylon ammodendron)苗木[24]的研究结果一致。IBA效果相对生根粉较好的原因可能是由于IBA仅含吲哚丁酸一种成分，对诱导生根的作用可能较生根粉稳定，也可能与物种本身有关。

不同浓度活性炭、IAA和嘧啶醇均能诱导生根，但诱导效果均较IBA差，不同浓度矮壮素基本不能诱导生根，此结果与前人在杉木[10]、紫背天葵[14]、芦笋[13]和萱草(Hemerocallis spp.)[23]中的研究结果不一致，可能是因物种间的差异造成的。

因此，本研究发现并优化了促进渐狭叶烟草组培苗生根的方法，在1/4MS+0.8 mg·L-1IBA培养基中组培苗最适宜生根。进一步测试该处理对渐狭叶烟草转基因苗生根的影响，发现0.8 mg·L-1IBA的添加，同样可以诱导转化了 NaERF1-like和NaMYB44-like RNAi载体的再生苗生根，培养20 d生根率可达60%。由此充分说明IBA对渐狭叶烟草组培苗生根的效果。

在同一年龄植物中，伤口损伤是决定根再生的主要因素[26]。本研究中，将20 d内未生根的转基因组培苗经组培继代方法优化(重新切除下部未生根愈伤，造成新的伤口损伤)，最终可使转基因组培苗生根率达到90%以上，且根及地上部分生长均良好，移栽后成活率较高。切口损伤促进生根可能是因为在伤口处诱导了生长素、茉莉酸和水杨酸的合成，进而引起植物根再生。

综上所述，优化的1/4MS+0.8 mg·L-1IBA培养基不仅在渐狭叶烟草组培苗中最适宜生根，且该培养基可以应用于渐狭叶烟草转基因组培苗生根，而且结合伤口诱导，最终生根率可达90%以上。本研究为高效获得渐狭叶烟草的转基因生根苗提供了解决方案，为渐狭叶烟草作为烟草属的一种模式植物研究提供便利，也为其他生根困难的植物提供了方法借鉴。