天然食品防腐剂的抑菌机理研究进展

2021-09-10朱燕莉王正莉王卫吉莉莉张佳敏白婷赵志平侯薄陈林

中国调味品 2021年9期

朱燕莉，王正莉，王卫，吉莉莉，张佳敏，白婷，赵志平，侯薄，陈林

(成都大学肉类加工四川省重点实验室，成都 610106)

世界范围内，有大约40%的食品腐败变质都是由微生物引起的，其中细菌和霉菌是导致食品腐败变质、品质下降的主要原因。为防止或延缓食品品质下降，除了传统的罐藏、冷冻、盐渍等保藏方法以外，使用食品防腐剂也是延长食品保质期非常普遍的方式。但越来越多的研究表明，有些化学添加剂具有致畸性、诱癌性等潜在的危害。考虑到化学合成防腐剂在使用过程中的安全局限性，天然抗菌物质因其安全、高效、广谱等特性逐渐成为研究热点，被广泛应用在食品、医药等领域。本文主要介绍了存在于植物、动物和微生物中的天然物质抗菌成分的抑菌机理以及目前国内外的研究进展。

1 抗菌物质的研究现状

1.1 化学合成防腐剂

食品在加工和贮藏过程中的腐败变质现象是食品行业面临的主要问题之一，目前普遍使用的抗菌物质是化学合成防腐剂，如山梨酸盐、亚硝酸盐和苯甲酸盐等，大多数化学防腐剂对人体有潜在的危害。Mamur等[1]研究发现，山梨酸钠对人体外周血淋巴细胞(PBL)有一定的基因毒性，并且山梨酸盐容易与蛋白质反应产生络合物，对人体也有潜在的毒害作用。多种防腐剂不宜共同使用，有报道称，在肉制品中，山梨酸盐和亚硝酸盐的共同使用存在形成诱变化合物的风险，不利于人体健康，在生产和加工中应该尽量减少使用[2]。

1.2 具有抗菌性的天然物质

随着居民饮食安全意识的不断提高，具有抗菌成分的天然物质受到社会各界的广泛关注，逐渐成为食品行业研究开发和广泛应用的热点。天然抗菌物质具有抗菌性强、热稳定性好和安全高效等优点，其主要来源于植物、动物和微生物，常见的有肉桂酸、溶菌酶、壳聚糖和乳酸链球菌素(Nisin)等，其中肉桂酸是酚类物质，酚类物质一般具有抗菌、抗氧化、抗褐变、防止酸败等作用，应用更加广泛，而非酚类物质，如大豆球蛋白碱性抗菌肽、糖醇类脂肪酸酯和蒜素等，主要表现出抗菌性。安全稳定的天然防腐剂可大大提高食品的品质，更好地维护人体健康。目前天然抗菌物质商业化应用的局限性在于机制和原理的探究较少，提取、分离和纯化等步骤繁杂，技术要求较高，且源于植物的天然物质有明显的季节性，在提取工艺中也需要加以考虑和调整。因此，探究抑菌机理是天然抗菌物质提取工艺优化和广泛应用的重要基础。

2 不同来源的天然物质抑菌机理

2.1 植物提取物

很多来源于植物的成分可作为天然抑菌物质使用，如肉桂、丁香、迷迭香、辣椒等物质的提取物，它们都具有很强的杀菌作用，可加工为天然防腐剂在食品中使用，有些也被制作为植物精油。

2.1.1 肉桂酸和肉桂醛

桂枝提取物可有效抑制菌体孢子的萌发，使细胞膜结构被破坏，膜的通透性增加，胞内电解质外泄，细胞结构的稳定性和菌体的物质代谢被影响、扰乱，导致菌丝无法正常发育繁殖，甚至致死。

肉桂酸的主要抑菌机理是抑制菌体的孢子萌发，破坏细胞膜结构，扰乱其物质代谢，并影响三羧酸循环(TCA)的过程，使菌体的能量代谢途径受到不同程度的阻碍，从而达到抑菌杀菌的效果。王秋亚等[3]研究发现，肉桂酸能够破坏菌体表面的磷脂双分子层，使得细胞膜的通透性增强，导致胞内渗出大量的电解质，增加胞内液体的电导率，蛋白质及其糖类随之减少，菌体结构的稳定性从而遭到破坏，其物质代谢过程被扰乱，致使菌丝无法正常生长发育。遭到破坏的菌丝往往呈畸形，表面常有皱缩、膨大的现象出现，菌丝扭结缠绕在一起或者断裂。谢丽玲等[4]研究表明，肉桂酸对菌体的呼吸代谢作用也可产生较大影响，对于能量代谢相关酶如琥珀酸脱氢酶(SDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)有较好的抑制效果，使氧化磷酸化过程以及电子能量传递等代谢途径受阻，从而影响、阻碍菌体生长，最后致使菌体死亡。在实际应用中将肉桂酸与巴氏杀菌助剂复配，能够显著增强杀菌防腐效果。

肉桂醛(C9H8O)是一种醛类有机化合物，大量分布于肉桂等植物体内。由于其分子结构为一个丙烯醛与一个苯基相连，因此被认为是丙烯醛的一种衍生物，自然界中存在的肉桂醛均为反式结构。

Shreaz等[5]研究表明，肉桂醛的抑菌机制不仅仅是单方面起作用，而是通过很多方面影响微生物的正常发育和代谢，并且不同浓度的肉桂醛对细菌细胞的抑制机理有差异，彼此间呈现剂量-效应关系。高浓度的肉桂醛通过对细菌细胞膜脂肪酸的分布产生影响，从而抑制酶活性，改变细胞膜的流动性，渗透作用增强的同时，细胞内物质外渗，导致菌体死亡；中等浓度的肉桂醛通过影响细胞内三磷酸腺苷(ATP)蛋白酶，抑制其活性，细胞内能量供应途径受阻，生物膜的合成遭到破坏，从而起到抑菌作用；低浓度的肉桂醛与菌体细胞内的物质相结合，如蛋白质、激素等因子，影响细胞的正常分裂，抑制菌体细胞的生长繁殖，从而达到抗菌的效果。

He等[6]研究发现，肉桂醛能够深入渗透到菌体细胞的内部，与细胞内DNA发生作用，阻碍DNA的正常合成。此外，还有一些研究表明，肉桂醛能够改变细菌内部的离子(Ca2+、K+和H+等)平衡，从而使细菌细胞死亡。

2.1.2 大豆球蛋白碱性抗菌肽(GAP)

抗菌肽原指昆虫体内经过诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质。自然界中的抗菌肽可分为植物抗菌肽、细菌抗菌肽和昆虫抗菌肽等若干种，几乎存在于所有生命体中。冯林慧等[7]在天然防腐剂的研究中发现，大多数抗菌肽来源于食物本身，例如GAP就是从豆粕中提取出来的一种植物来源的阳离子肽，它具有广谱抑菌的特性，且不会对人体健康产生危害和毒副作用。关于抗菌肽的杀菌抑菌机理，现在普遍的观点是膜损伤机理和膜内物质损伤机理。

膜损伤机理认为，抗菌肽通常作用于菌体细胞膜。Dean等[8]的研究发现，抗菌肽具有阳离子特性和两亲性，当抗菌肽接触细胞膜时，彼此识别聚集到一起，在静电作用的吸引下，抗菌肽与带负电的磷脂细胞膜相结合，疏水基团进入细胞膜深处的疏水层，疏水端暴露，细胞膜的通透性发生改变，其结构和完整性也遭到破坏，胞内物质泄露，膜电位随之降低，细胞的能量代谢过程被影响，生存能力受到威胁，严重时导致细胞死亡。

关于膜内物质损伤机理的研究和报道很少。抗菌肽不仅可以破坏细胞膜，还可以损害细胞内核酸和蛋白质等大分子物质，进而影响菌体细胞的代谢等正常生理活动。研究发现，有些抗菌肽能与大肠杆菌的DNA结合，改变其结构，从而影响菌体细胞的正常生理功能，但是大肠杆菌的细胞膜不会遭到明显的破坏。

大豆球蛋白碱性抗菌肽(GAP)是阳离子型抗微生物肽，GAP通过改变细菌细胞膜的通透性，使细胞内钙、钾离子泄露至细胞外，引起细胞局部结构发生改变形成细槽，从而导致细胞的塌陷。研究表明，GAP可明显抑制大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和单增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等。

GAP能够破坏单增李斯特氏菌的细胞形态，影响其生理代谢。首先，Vidal等[9]在研究中发现，GAP通过自身所带的正电荷中和单增李斯特氏菌表面所带的负电荷，引起电势差的减小，菌体细胞膜出现去极化现象，从而使细胞膜的完整性遭到破坏。其次，GAP对单增李斯特氏菌细胞膜的作用使其通透性发生改变，进一步导致细胞内物质的泄露，致使DNA遭到破坏，随之降解。此外，GAP可以抑制单增李斯特氏菌呼吸链脱氢酶和ATP酶的活性。最后，GAP也可以通过影响菌体细胞呼吸代谢途径中的EMP途径，使菌体的呼吸代谢遭到抑制和破坏[10]。

GAP对金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌活性。Yang等[11]研究表明，GAP会严重破坏金黄色葡萄球菌的细胞膜，导致细菌膜的渗漏和胞内物质的流出。此外，GAP能够抑制金黄色葡萄球菌非特异性酯酶和ATP酶的活性，扰乱细菌正常的生长和繁殖。对于金黄色葡萄球菌来说，GAP的抑菌活性取决于其对细胞膜的破坏程度以及胞内活性氧的产生剂量。GAP诱导细菌活性氧的产生，而产生的活性氧则会使菌体出现不同程度的氧化应激反应。Aruldass等[12]在研究中发现，低剂量的活性氧可减轻细胞损伤，而高剂量的活性氧则会使一些细胞大分子物质如蛋白质、DNA等变性和降解，细胞的结构和细胞内介导的功能遭到破坏，从而导致活性氧介导的细菌细胞凋亡，达到抗菌效果。

2.2 动物提取物

来源于动物的抑菌提取物是指主要从与动物相关的物质中提取得到的具有天然抗菌成分的物质，如鱼精蛋白、壳聚糖和动物型溶菌酶等。

2.2.1 溶菌酶

溶菌酶(Lysozyme)是一种水解酶类，可专门作用于微生物的细胞壁。它是由18种、129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，可以分解N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)残基之间的β-1,4糖苷键，是许多生物先天免疫系统的重要组成成分。溶菌酶作为一种天然抗菌物质，由于可在肠胃内被消化吸收，不会危害人体健康，因此被广泛应用于食品、医药和饲料等领域。

人们普遍认为，溶菌酶的抑菌机理主要是通过破坏微生物的细胞壁，对细菌骨架物质——聚糖的降解反应进行催化，从而导致菌体细胞裂解而死亡。

根据溶菌酶作用对象的不同和菌体细胞壁成分的不同，可将其分为细菌型细胞壁溶菌酶和真菌型细胞壁溶菌酶。对于细菌来说，溶菌酶主要作用于两个部位：一是肽聚糖的β-1,4糖苷键处；二是肽链的酰胺部分和“尾”端。Yu等[13]研究发现，C型溶菌酶主要存在2个结构域，高度保守的天门冬氨酸52和谷氨酸35残基组成其催化位点，与肽聚糖底物在裂缝内深处结合，NAM和NAG之间的糖苷键遭到破坏，从而导致细菌的裂解死亡。对于真菌来说，溶菌酶的主要作用对象为酵母细胞壁的β-1,3-D-葡聚糖、β-1,6-D-葡聚糖、甘露聚糖和霉菌细胞壁的壳多糖，它对于酵母菌和霉菌有一定的溶解作用。由此，溶菌酶发挥作用的特异性很强，菌种不同，作用的底物和部位也会有差异。

由于溶菌酶能够专门作用于菌体细胞壁，而不会影响干扰细胞其他部位，革兰氏阳性菌的细胞壁约90%都是肽聚糖组成的，因此溶菌酶对革兰氏阳性菌的抑制效果十分显著。此外，溶菌酶对于枯草芽孢杆菌有极其显著的分解作用，对大肠杆菌等革兰氏阴性菌也有溶解作用。

溶菌酶对微生物细胞壁的破坏并不是它抑菌的唯一机制，研究表明，溶菌酶能够迅速增加大肠杆菌外膜的渗透性，使外膜形成孔洞结构，对大肠杆菌的内膜也具有直接的抑制作用[14]。

2.2.2 壳聚糖

壳聚糖(Chitosan)的分子式为(C6H11NO4)n。其天然储备量较为丰富，常来源于蟹虾、昆虫等动物硬壳。壳聚糖是一种天然碱性多糖物质，通过脱乙酰化反应从甲壳素中提取，因其具有无毒、可降解、抗微生物等优良特性，被广泛应用于食品、医药和工业降解等领域。

国内外学者对壳聚糖的抗菌机制做了大量实验与研究验证，目前被广泛认可的机理有以下4种：

第一，壳聚糖的抗菌活性源自其氨基(NH2)所带的正电荷(NH3+)。Costa等[15]在研究中发现，当pH

第二，Obianom等[17]通过研究壳聚糖对不同酶基因的表达，发现其分子降解的产物可以经过多层相互交联的细胞壁屏障到达细胞内部，干扰细胞内DNA，抑制蛋白质和mRNA等物质的合成，导致基因表达发生变化，关键酶的活性降低，影响微生物的正常生长和代谢。

第三，Sebti等[18]研究发现，壳聚糖还具有螯合金属离子的能力。当pH>pKa(6.3)时，壳聚糖能够非常好地吸收螯合金属阳离子，同时作用于带有阴离子的细胞膜，从而改变细胞膜的渗透性，使菌体表面形态被破坏，导致细胞内物质泄漏。

第四，根据其聚合成膜的特性，壳聚糖还可以形成一层不透气的涂膜来抑制微生物生长。该膜阻止营养物质进入细胞的同时也阻止了O2的进入，从而起到了抑制好氧型微生物生长繁育的作用。

但是，壳聚糖在中性和碱性条件下的抗菌效果不如酸性环境条件下的。对此，有学者对壳聚糖的改性进行了研究，如壳聚糖交联改性、壳聚糖酰基化改性和壳聚糖酯化改性等，有望提高其抑菌性能。

2.3 微生物类抗菌物质

微生物类抗菌物质是一类具有抑菌活性的物质，由微生物生长代谢产生，主要包括多肽和有机酸等。这些物质分子量小，结构紧密，能够轻易进入到细胞内部，可以较好地抑制一些微生物的生长繁殖。

乳酸链球菌素(Nisin)是由乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)产生的一类两亲性阳离子多肽。在代谢过程中，通过核糖体的相关合成机制产生具有杀菌效果的多肽或蛋白，Nisin的化学式为C143H230N42O37S7，由34个氨基酸残基组成。它对革兰氏阳性菌和芽孢杆菌的孢子均具有强烈的抑制作用，是目前世界上唯一允许被用作食品添加剂的细菌素。

与传统抗生素相比，Nisin的抑菌机制十分独特。章银良等[19]在防腐剂抑菌性能的研究中发现，Nisin主要作用于繁殖体的细胞膜，阻碍细胞膜磷脂化合物的合成途径，使硫氢基团的活性降低甚至失去活性，造成细胞膜功能的损害，从而导致了细胞的裂解，胞内物质泄露，同时也抑制了细菌细胞壁中肽聚糖的合成。Bauer等[20]研究认为，Nisin对菌体的抑制作用主要是在于脂II(Lipid-II)分子结合的过程中形成孔洞复合物，这种Nisin-Lipid-II孔洞复合物能够在纳摩尔级的浓度下对细胞膜造成损害，例如在膜上穿孔，胞内氨基酸、ATP和离子的泄露等，最后导致菌体死亡。脂Ⅱ分子在细菌细胞壁合成的过程中起着非常重要的作用，是一种不可或缺的中间体。因此，Nisin与脂II分子的结合会严重干扰细胞壁的合成，从而起到抑菌的作用。在实践中，高温灭菌与Nisin同时搭配使用，能够大幅度提升此效果。

Nisin对于芽孢的抑制作用主要是在芽孢萌发的前期破坏它的膜结构，抑制其发芽，而不是杀死芽孢。但是Nisin对革兰氏阴性菌的作用不大，对酵母菌和霉菌几乎没有任何影响，可能的原因是革兰氏阴性菌细胞壁中含有的脂多糖在对抗Nisin时发挥了屏障作用，有效阻挡了Nisin对细胞膜的破坏。在取代化学添加剂的可能性方面，实验证明，不同质量分数的Nisin、壳聚糖和植物提取物复配，在川菜中的抑菌效果与添加一定量的山梨酸钾相当，能够有效抑制微生物的生长繁殖，甚至作为天然防腐剂代替山梨酸钾。同时，Nisin也可参与发酵过程，在白酒发酵过程中适当加入Nisin，可有效抑制白酒中乳酸菌的生长，在酱油中加入Nisin也能够抑制一些特定菌种的生长繁殖，使酱油的品质得以提升[21]。

3 不同天然物质的抑菌效果

不同天然物质抗菌成分的抑菌机理可以分为以下几种：

(1)对菌体细胞壁或者细胞膜结构的破坏，破坏其屏障功能，使胞内物质泄漏；

(2)作用于细胞内部的核酸和蛋白质等物质，影响其表达和合成，使细胞丧失生长的物质基础；

(3)抑制菌体内能量相关酶的活性，使其代谢过程受阻，影响细胞的呼吸作用和正常生长。

以上若干种天然抗菌物质中，肉桂酸和肉桂醛对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等有明显的抑制作用，此外，肉桂酸抑制真菌的效果最好。大豆球蛋白碱性抗菌肽(GAP)对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特氏菌均具有明显的抑制效果。溶菌酶对革兰氏阳性菌的作用效果十分显著，对革兰氏阴性菌仅有一定的溶解作用，效果较弱，研究发现，溶菌酶和Nisin对革兰氏阳性菌具有协同作用。壳聚糖对细菌、真菌甚至病毒都有较好的抑制效果，但是壳聚糖的水溶性很差，只能少量地溶解于稀酸溶液，抗菌能力较温和。乳酸链球菌素(Nisin)对革兰氏阳性菌的抑制效果非常显著，对酵母菌和霉菌几乎没有明显的作用，最近研究表明，Nisin联合EDTA一起使用，对沙门氏菌和革兰氏阴性菌也有较为明显的抑制作用。