C反应蛋白激活原纤毛抑制颅骨成骨细胞的增殖和分化

许洁 刘杰 汪长东

重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室，肿瘤与分子医学中心，基础医学院，重庆 400016

骨是经历不断成骨细胞构建和破骨细胞降解的组织。炎症会扰乱骨骼的新陈代谢并促进骨丢失，如类风湿关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病和其他疾病等[1]。炎症性疾病对骨骼产生影响，增加骨折风险。炎症反应使得细胞因子被激活，如干扰素、白介素、趋化因子等，这些炎症性细胞因子激活骨骼降解并抑制骨骼生成。C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是Pentraxin家族的一种古老且高度保守的蛋白。血浆CRP主要在肝脏中产生，由肝细胞对诸如白介素IL-1β和IL-6炎症性细胞因子的响应而合成[2]。临床实践中，CRP是典型的急性期反应标志物，半衰期短。但CRP如何影响骨组织，至今仍不清楚。细胞原纤毛与骨发育联系密切。原纤毛是从细胞表面突出的基于微管的小型细胞器。它们充当触角，通过位于原纤毛膜上的各种表面受体来感应细胞外信号，如生长因子和激素，通过正向转运蛋白Kinesin-Ⅱ将信号从原纤毛的底部转运到原纤毛的顶部，或者逆向转运蛋白Dynein将信号从原纤毛顶部转运到原纤毛底部[3]。原纤毛缺陷会导致纤毛疾病，如窒息性窘迫呼吸综合症和短肋骨多趾综合症Ⅲ，提示纤毛在骨骼发育中起着不可或缺的作用[4-5]。CRP体外是否影响成骨细胞增殖和分化以及是否通过原纤毛尚未报道。据此，笔者研究CRP对成骨细胞增殖、分化作用，进而发现炎症环境是否对成骨增殖和分化有影响以及如何影响，为CRP应用于检测炎症诱发的骨丢失疾病诊断提供理论依据，为治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 颅骨细胞获取

1.1.1颅骨细胞分离、培养：动物操作按照重庆医科大学IACUC批准的规程进行。3～4 d的Sprague-Dawley(SD)乳鼠通过二氧化碳安乐死。在无菌台中取出乳鼠的颅盖骨，去除骨膜及周围结缔组织，PBS冲洗4～5次并剪成细小碎块。并将I型胶原酶(2 mg/mL，EMD，Darmstadt，Germany)和胰蛋白酶(0.25%，Corning，Manassas，VA)按1∶1混合，全程在37 ℃恒温水浴锅上消化1～2 h。1 000 r/min离心5 min，弃上清液保留沉淀。用PBS洗2次，然后离心分离并铺板于含10%胎牛血清(FBS)，100 U/mL青霉素和1 mg/mL链霉素的α-MEM中。将细胞置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。24 h后观察细胞贴壁状态，更换培养液，弃去未贴壁的细胞及残留的骨组织碎块，以后每3 d观察细胞状态，更换培养基一次。待细胞布满视野80%，镜下观察细胞形态并拍照。

1.1.2茜素红染色：OS培养基诱导成骨分化21 d。OS培养基是由α-MEM(Gibco)其中包含10%FBS，10 mmol/L β-甘油磷酸(Sigma，St Louis，MO)，50 μg/mL抗坏血酸(Sigma)和10-8mol/L地塞米松(Sigma)组成的。在用OS培养基诱导21 d，去除培养基，PBS漂洗贴壁细胞3次，将细胞用5%多聚甲醛固定10 min。PBS漂洗3次，室温下用40 mmol/L茜素红S溶液(pH 4.4)染色，并用去离子水冲洗两次。细胞用10 mmol/L磷酸钠(pH 7.0)中的等量10%(w/v)的cetylpyridinium chloride(sigma)脱色15 min。然后将等体积的所需溶液转移至96孔板，562 nm测定吸光度。

1.2 免疫荧光

细胞爬片(American)用酒精消毒烤干放置于24孔板上，将细胞以4×104细胞/孔的密度接种，CRP(5 mg/mL)处理细胞3 d。PBS洗涤3次，4%甲醇固定10 min，PBS洗涤3次。为避免非特异性结合，5%BSA孵育60 min。Ki-67抗体(1∶200，Santa cruze)，α-微管蛋白抗体(1∶1 000，T6793，Sigma)和γ-微管蛋白抗体(1∶1 000，T3320，Sigma)4 ℃孵育过夜。lexa Fluor 568偶联的抗兔抗体(1∶1 000，A-11011，Invitrogen)和Alexa Fluor 647偶联的抗小鼠抗体(1∶1 000，A-21235，Invitrogen)作为二抗室温孵育1 h。DAPI的抗褪色染液(1∶1 000，Sigma)复染细胞核，使用Leica DM4000显微镜观察细胞并照像。

1.3 蛋白质印迹

收集CRP处理3 d后细胞的总蛋白，BCA蛋白测定试剂盒(Pierce，Rochford，IL)测量蛋白浓度。10%SDS-PAGE凝胶分离。25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸和20%甲醇的缓冲液中，将蛋白质转移到PVDF膜上。用5%的牛奶封闭，一抗在4 ℃孵育过夜，乙酰化的α-微管蛋白抗体(1∶1 000，T6793，Sigma)和γ-微管蛋白抗体(1∶1 000，T3320，Sigma)检测原纤毛，OPN(1∶200，225952-1-AP，Proteintech)和ALP(1∶1 000，Cat A5111，Selleckchem)检测成骨分化，GAPDH(1∶1 000，YT5052，ImmunoWay)作为对照，然后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗兔IgG抗体(1∶10 000，A-11034，Novex，Carlsbad，CA)或辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗小鼠IgG抗体(1∶5 000，#7074，Cell Signaling Technology)室温孵育1 h。可视化使用Western Bright ECL HRP(Advansta，San Jose，CA，USA)进行。

1.4 统计学分析

所有数据均以平均值±标准误差表示。对两组进行比较的Studentt检验分析。P<0.05为差异有统计学意义。使用GraphPad Prism程序(GraphPad Software，Inc，San Diego，USA)进行分析。

2 结果

2.1 成功分离并培养原代ROB

取出生3～4 d的SD大鼠乳鼠颅骨组织提取原代ROB，α-MEM培养基培养。在倒置显微镜下，刚分离的ROB呈圆球形漂浮在培养基内。24 h后，成骨细胞贴壁，细胞展开(图1A)，3 d后细胞布满视野，贴壁的细胞呈梭形、三角形和多边形(图1B)。传代后细胞逐渐展开，体积增大。细胞5 d能铺满培养皿底，最后重叠生长，呈铺路石状(图1C)。14 d后成骨钙化结节在一定区域内堆集成灶，与茜素红S溶液反应可见橙红色钙化结节，着色中间深周围浅，多个钙化结节可相互融合。比例尺为100 μm(图1D)。

图1 成功分离并培养原代ROB

2.2 CRP抑制成骨细胞增殖

用或不用CRP(5 mg/mL)将ROB细胞处理3 d。用DAPI复染细胞核，Ki-67抗体与ROB胞浆上的Ki-67抗原结合，表现为胞浆内散在分布的绿色荧光。比例尺为100 μm(图2A)；用Image J对上述两组细胞Ki67相对荧光表达水平进行定量分析，对照组与处理组相比Ki-67的平均表达量分别是7.124±0.580、2.360±0.148(P<0.001，n=3)。处理组荧光水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.001，n=3；图2B)。这些数据表明，CRP抑制ROB细胞的增殖。

图2 CRP抑制成骨细胞增殖

2.3 CRP抑制成骨细胞分化

单纯用OS培养基或与5 mg/mL的CRP作用21 d后对ROB进行茜素红染色。结果显示，经过21 d成骨诱导培养基培养，CRP处理组细胞钙结节沉积明显少于对照组未用CRP组的细胞钙结节(图3A)；显微光镜下观察矿化结节。比例尺为100 μm(图3B)；基于3A图的茜素红染色的定量矿化水平，对照组茜素红定量为4.06±0.17，处理组茜素红定量为2.54±0.26，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.001，n=3；图3C)；用或不用5 mg/mL的CRP处理3 d后，对ROB中OPN和ALP表达的蛋白质印迹分析(图3D)；基于3 d免疫印迹中OPN和ALP蛋白水平的定量分析。OPN和ALP的蛋白质水平被标准化为GAPDH。蛋白免疫印迹显示，对照组的OPN蛋白定量为67.77±3.39，处理组的OPN蛋白定量为44.93±2.25，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01，n=3；图3E)；蛋白免疫印迹显示，对照组的ALP蛋白定量为151.65±7.58，处理组的ALP蛋白定量为103.77±5.19，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.001，n=3；图3E)。这些数据表明，5 mg/mL浓度的CRP抑制ROB成骨分化。

图3 CRP抑制成骨细胞分化

2.4 CRP激活成骨细胞原纤毛

对用或不用CRP处理的ROB中原纤毛长度进行免疫荧光分析。原纤毛用乙酰化α-微管蛋白(纤毛轴突，绿色)和γ-微管蛋白(基体，红色)抗体染色。该图显示了基体和轴突的高倍图像。DAPI染色用作复染(蓝色)。比例尺为20 μm(图4 A)；对细胞原纤毛长度进行定量分析。结果显示，处理组原纤毛长度长于对照组原纤毛长度，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.001，n=3；图4B)；用或不用CRP处理ROB，对原纤毛代表蛋白进行免疫荧光分析。比例尺为100 μm(图4C)；用Image J对图4C视野上的纤毛表达量进行定量分析。处理组荧光强度强于对照组，相比差异有统计学意义(P<0.001，n=3；图4D)；对原纤毛代表蛋白进行蛋白质印迹分析(图4E)；基于图4D免疫印迹结果的定量分析。纤毛蛋白水平用GAPDH标准化。蛋白免疫印迹显示，处理组乙酰化α-微管蛋白和γ-微管蛋白表达高于对照组，相比差异有统计学意义(P<0.001，n=3；图4F)；这些数据表明，5 mg/mL浓度的CRP异常激活了ROB原纤毛。

图4 CRP激活成骨细胞原纤毛

3 讨论

炎症是局部和全身性骨质流失的主要且高度被忽视的原因，最终可能导致残疾和死亡。本研究结果表明，炎症因子CRP可以抑制成骨细胞增殖和成骨分化从而导致骨丢失，这是通过增加细胞原纤毛表达介导的。炎症的特征是产生炎症因子，其可以激活骨分解并抑制骨生成[6]。CRP是炎症和组织损伤的敏感的全身性标志物，文献表明，炎性疾病与全身性骨质疏松症和骨折率增加有关[7]。本研究在SD乳鼠ROB细胞中检查了CRP在骨组织中的作用，发现CRP抑制SD乳鼠ROB增殖和成骨分化。

参照Fang等[8]、Yoshida等[9]、Jimenez等[10]的研究，本实验提取出生3～4 d SD乳鼠颅骨原代细胞ROB，用5 mg/mL浓度的CRP处理ROB。结果显示，与对照组比，CRP处理的ROB在3 d时免疫荧光检测Ki-67荧光强度明显降低，表明CRP抑制成骨细胞增殖，与Chen等[7]的结果相符。与本研究结果一致的是，Jimenez等[11]确定了CRP显著增强了髓样衍生细胞抑制CD3/CD28刺激的T细胞增殖的能力。重要的是，CRP还使新鲜分离的原代人中性粒细胞能够抑制自体T细胞的增殖，加剧小鼠急性肾损伤。同样，Tang等[12]发现，在急性肾脏损伤(AKI)缺血/再灌注小鼠模型中CRP含量明显增加且抑制肾小管上皮细胞(TEC)再生，在人TEC系(HK-2)中添加CRP也同样抑制G1/S依赖的TEC增殖再生。但是，不管在体内或体外，关于CRP对成骨细胞增殖的影响的数据很少，CRP对骨组织的影响研究不明朗。这项研究结果进一步表明，CRP可能是炎症引发的骨丢失的重要因素，CRP抑制成骨细胞增殖。

就成骨分化而言，茜素红染色实验是检测成骨细胞分化成熟的最重要指标。骨桥蛋白(OPN)是在骨形成过程中矿化过程的后期产生的，是成骨分化过程的关键蛋白。碱性磷酸酶是一种膜结合酶，用于水解焦磷酸盐，为细胞提供必需的无机磷酸盐(Pi)。本研究结果显示5 mg/mL的CRP处理组均出现了比对照组明显减少的矿化结节数以及OPN和ALP含量的降低。实验结果证实CRP显著减弱成骨细胞的矿化能力。与本研究观点相符的是，Liang等[13]在类风湿关节炎中发现，来氟米特可以诱导AHR-ARNT相互作用，从而抑制CRPL关节炎大鼠的肝CRP产生并减轻骨侵蚀。同样，Liang等[13]向CRP H CIA大鼠关节内注射PBS，IgG对照或抗CRP抗体。发现与IgG或PBS相比，抗CRP抗体可减轻CRP H大鼠的骨质侵蚀和骨吸收，并防止骨质流失，充分说明CIA大鼠通过CRP导致骨侵蚀[13]。有研究直接指出，CRP可以诱发关节炎兔的炎症延长，并直接促进破骨细胞的形成，引起骨丢失[14]。这些研究表明，CRP和骨丢失之间有着密切的联系，尽管CRP的因果作用仍然不确定。

众所周知，原纤毛的结构影响物质交换。原纤毛长度变化预示原纤毛功能改变[15]。本研究的一个新的重要发现是CRP通过增加细胞原纤毛的表达来引起骨丢失，原纤毛是骨组织损伤的关键。研究发现，ROB被CRP处理后，细胞原纤毛比以往的成骨细胞增长甚至变多，提示炎症可能导致成骨细胞原纤毛发生变化，从而导致骨丢失。Zhou等[16]发现经由Wnt10b/β-catenin信号传导的成骨促进作用取决于成骨细胞中原纤毛的功能完整性。Moore等[17]发现骨膜祖细胞促进成年小鼠负荷诱导的骨形成，并需要原纤毛感知机械刺激。另一方面，Baek等[18]通过研究脂多糖诱导产生的神经炎症发现原纤毛调控了炎症介质的表达。同样，Wann等[19]发现在炎症因子白细胞介素-1(IL-1)作用下原纤毛的增长，测试原纤毛参与介导下游炎症反应，结果表明原纤毛调节炎症因子反应。这些发现表明，原纤毛参与了炎症与骨丢失的调节，而本研究发现CRP通过激发细胞原纤毛表达破坏骨生成过程。

大多数慢性炎性疾病的原因尚不清楚，因此必须使用专门针对炎性过程的治疗策略。如上所述，促炎细胞因子不仅在炎症的最终途径中起作用，而且还影响成骨细胞的活性，导致全身性骨丢失。因此，减少和理想地消除炎症仍然是重要的治疗目标。本研究应用酶消化法获得SD大鼠乳鼠颅骨细胞，传代2次后用于后续实验，主要研究了5 mg/mL的CRP对SD大鼠乳鼠颅骨细胞ROB的增殖、成骨分化和基质矿化的作用。结果发现，在5 mg/mL浓度下CRP对细胞增殖能力，成骨分化抑制。同时，CRP使细胞原纤毛蛋白含量急剧增多，细胞原纤毛数量增加，长度变长，CRP促进了细胞原纤毛的表达。总之，本研究结果表明，CRP可能不仅是炎症标志物，还是导致骨丢失的致病介质。CRP通过促进细胞原纤毛的表达来抑制成骨细胞增殖和成骨分化，因此CRP或可成为检测骨丢失的指标之一，成骨细胞原纤毛可能为炎症引起的一系列骨病提供潜在的治疗靶点。