负载成骨生长肽的静电纺丝PLGA 支架可加速大鼠颅骨缺损再生

王 聪，桑伟林，陈燕敏，宋滇文

1南京医科大学附属上海一院临床医学院骨科，上海 201620；2上海市第一人民医院教育处，上海201620

由创伤、肿瘤切除、感染等造成的骨缺损仍然是一个临床挑战［1,2］。骨组织工程学的发展为修复骨缺损开辟了新途径，旨在通过生物材料、细胞和骨生长因子协同组合诱导新的功能性骨再生，其中的关键组件是为新生骨组织提供结构支撑的支架材料。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是一类经FDA批准的具有良好生物相容性、低免疫源性的可生物降解高分子材料，在骨组织修复中有较大的应用研究前景［3］。但PLGA本身缺乏成骨活性，这极大地阻碍了其在骨组织工程中的应用。成骨生长肽（OGP）是一种由14个氨基酸构成的天然短肽［4-6］，研究发现OGP可以加速体内骨愈合速率，增加骨小梁的密度和质量［7］，在骨组织修复中具有极大的临床应用前景［8,9］。目前，OGP已经被负载于PLGA大孔支架［3］，各种聚合物膜［10-12］，包括：细菌纤维素、胶原蛋白和脲醛树脂-聚醚，以及3D打印支架［13,14］等材料，用于骨组织修复和再生。利用静电纺丝制备的纤维支架具有孔径小、纤度细、比表面积大等优点，是一种理想的组织工程支架［15］。然而，对于OGP 负载于PLGA静电纺纳米纤维支架的研究未有报道。为了更有效地促进骨组织的再生，有必要寻找合适的OGP浓度来负载PLGA纳米纤维支架。

在PLGA纳米纤维支架中，引入成骨生长肽OGP，可使两者的性能互补。本文通过静电纺丝技术制备了含有不同浓度OGP 的PLGA 纤维支架（OGP @PLGA），为了评估OGP@PLGA支架在骨组织工程中的应用潜力，本文表征了支架的微观结构、OGP释放率、生物相容性及成骨活性，为该支架材料的临床应用提供前期的实验基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料及试剂

聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA，70:30）（山东岱罡生物工程有限公司）；六氟异丙醇（HFIP）（上海达瑞化学有限公司）；成骨生长肽（OGP）（上海源叶生物有限公司）；碱性磷酸酶试剂盒，茜素红S染液以及PBS缓冲液（北京索莱宝生物科技有限公司）；DMEM/F12，胎牛血清（FBS），青霉素和链霉素溶液（Gibco）；大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）（中国科学院上海细胞库）；钙黄绿素-碘化丙啶试剂盒，CCK-8试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）；人源成骨生长肽Elisa试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）；鬼笔环肽（Phalloidin）和4',6-双脒基黄-2-苯基吲哚（DAPI，Thermal Scientific）。

1.2 材料制备

将PLGA溶解在HFIP中，形成质量分数为20%的溶液，在室温下搅拌2 h后，往混匀的溶液中加入质量体积比为0.1%、0.2%、0.4%的OGP，继续搅拌12 h，然后将混合溶液转移至体积为10 mL的医用注射器中，连接上型号为20 G的针头，随后将注射器置入静电纺丝机中的推进泵，电压大小设置为12 kV，推进泵速率设定为1.2 mL/h，并在推进泵下方放置一块大小为30 cm×30 cm的铝箔纸片作为接收板，该接收板与推进泵上针尖的距离为15 cm，整个纺丝过程约为1.5 h。纺丝过程结束后，将接收板上纤维膜揭下来放置于真空干燥箱中48 h，以除去膜上残留的有机溶剂。具有不同重量比的OGP（0.1%、0.2%和0.4%）的OGP @ PLGA 分别命名为0.1%OGP@PLGA，0.2%OGP@PLGA和0.4%OGP@PLGA。

1.3 形貌表征

将制备得到的支架裁剪成合适大小的样品，然后以10 kV的加速电压将金溅射在大孔支架表面，并在SEM（Phenom，XL，Netherland）中观察支架的微观形貌。使用Image J 1.40软件（NIH，美国）对典型SEM图像进行至少50次测量，得到支架的平均纤维直径。

1.4 体外多肽缓释

将膜材料裁剪成大小一致，且质量接近的样品，然后将样品浸入装有PBS（pH 7.4）的离心管中，样品质量与溶液体积比例为1∶10，离心管放置在摇床里，摇床温度为37 ℃，振荡速率为120 r/min。每隔24 h从离心管中吸取50 μL的浸提液，并补充新鲜的PBS 50 μL。将浸提液统一保存在-20 ℃冰箱中，最后根据产品说明书用Elisa试剂盒测定支架上OGP的释放量。

1.5 体外生物相容性

1.5.1 rBMSCs细胞的培养 rBMSCs细胞购买自中科院上海细胞库。细胞培养在体积为37.5 cm2大小的细胞培养瓶中，使用的培养基为DMEM/F12培养基，培养基中含有1%的双抗和10%的胎牛血清。应用常规细胞恒温培养箱培养细胞，内部CO2体积分数为5%，温度为37 ℃，湿度为95%，待细胞融合度达80%以后，去除培养基，加入含EDTA 的胰酶消化细胞传代，比例为1∶3。

1.5.2 细胞活性测试 将支架裁剪成直径为14 mm大小的圆片，置于24孔板细胞培养板中，紫外灯照射灭菌60 min，随后用少量PBS湿润材料，将处于对数生长期的细胞消化下来，借助Countstar细胞计数仪将细胞悬液浓度调整至5×104/mL，接种1 mL细胞悬液到材料上，然后培养细胞。分别在接种后的第1、4和7天取出接种有细胞的支架，用PBS洗涤后，每个支架上滴入200 μL配置好的钙黄绿素-碘化丙啶混合液，避光孵育45 min，随后用PBS 洗涤2 遍，置于荧光倒置显微镜（BX53，Olypmus）下观察拍照。

1.5.3 细胞增殖实验 将密度为5×104/mL（1 mL）的rBMSCs接种到直径为14 mm的材料上，在第1、4和7天时用PBS洗涤3遍，然后向每个材料上滴加300 μL 含有10%CCK-8的未完全培养基，避光孵育90 min，然后从每孔中取100 μL转移到96孔板中，用酶标仪于450 nm的波长处测得各孔的吸光度（A450nm）。

1.5.4 细胞骨架染色 将密度为5×104/mL（1 mL）的rBMSCs接种到直径为14 mm的材料上，在第3天时将样品用PBS洗涤3遍，随后用4%低聚甲醛于4 ℃固定2 h，用0.1%Triton X-100透化，并用1%BSA封闭30 min，然后用Phalloidin和DAPI避光染色10 min。用激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）（LSM 700,Zeiss,Germany）拍摄图像。

1.6 体外成骨分化评估

1.6.1 ALP活性测试 研究表明，碱性磷酸酶（ALP）是反映成骨细胞活性或功能状况的重要指标。因此本实验我们将密度为1×106/mL（1 mL）的rBMSCs 接种到14 mm直径的支架上，每隔3 d更换一次新鲜的骨诱导培养基。在第7、14天时分别吸出培养基，用PBS洗涤3次后加入300 μL 0.2%Triton-X裂解细胞，随后在4 ℃下高速离心5 min，然后再根据ALP试剂盒和BCA试剂盒说明书计算每组中ALP的含量。

1.6.2 ARS染色 茜素红染色（ARS染色）能够检测干细胞分化为成熟成骨细胞后在细胞表面沉积的钙盐，即钙结节。因此将密度为1×106/mL（1 mL）的rBMSCs接种到14 mm直径的支架上，每隔3 d更换一次新鲜的骨诱导培养基。在第7、14天时分别吸出培养基，用4%的多聚甲醛在4 ℃下固定样品30 min，随后用去离子水清洗样品3 次，在室温下用2%浓度的茜素红S 染料染色10 min，随后吸除多余的溶液，用倒置显微镜（BX53,Olypmus）观察矿化结节的数量。

1.7 动物实验

1.7.1 模型建立 从上海杰斯杰实验动物有限公司购买了平均体质量为280～300 g 的雄性SD 大鼠（20180004025675），随机分为3组。所有手术均在上海第一人民医院动物中心进行，已获得上海第一人民医院动物保护与使用委员会（批准号：2019AWS0008）的批准。首先持续通入3%异氟醚对SD大鼠进行麻醉，常规消毒，铺单后沿颅骨中线切开表皮，小心分离皮肤、软组织、骨膜后，暴露出大鼠平坦颅骨，用环钻小心切割出直径为5 mm的圆形骨缺损，然后随机植入3组不同的材料，分别是空白对照组，纯PLGA组以及0.4%OGP@PLGA组，随后逐层缝合伤口。术后8周，所有大鼠均腹腔注射过量戊巴比妥钠致死，用于后续实验分析。

1.7.2 Micro-CT检测 为检测颅骨骨质形成情况，我们采用Micro-CT（Skyscan 1176,Belgium）对固定后的样本进行扫描检测，参数设定为电压65 kV，电流100 μA，分辨率120 μm。同时将扫描后得到的二维图像通过内置的SkyScan CTVOX2.1软件重构三维图像。

1.7.3 组织形态学分析 为进一步从组织形态学角度检测颅骨骨质形成情况，我们将所得颅骨样品用10%EDTA脱钙4 周，随后用去离子水不断冲洗掉剩余脱钙液，依次放入梯度浓度的乙醇溶液（70%，80%，90%，95%，100%）脱水2 h，再用常规石蜡包埋样品，进行切片，切片厚度为5 μm，随后切片转移到65 ℃烤片机上烘烤2 h，最后按厂商说明书进行HE和Masson染色，其中HE染色主要从整体水平检测新生骨组织结构，Masson染色则主要检测细胞外I型胶原形成情况。

1.8 统计学分析

利用origin 2019b软件处理数据，实验中的计量数据釆用均值±标准差来表示。单因素方差分析进行组间检验，当P＜0.05时，表示差异具有统计学意义，以上每组实验测试至少3个平行样本。

2 结果

2.1 形貌表征

图1A～D 为本实验制备的含不同浓度OGP 的PLGA纤维支架的扫描电镜图，可以得出四组膜支架都是由均匀连续的微纳纤维相互堆叠而成，没有断裂纤维及空泡形成。如图1E所示，依据Image J图像分析软件测得PLGA组的平均纤维直径为2.117±0.408 μm，其他三组的纤维直径为2.283 ± 0.347 μm（0.1%OGP@PLGA）、1.997±0.398 μm（0.2% OGP@PLGA）和2.025±0.509 μm（0.4%OGP@PLGA）。如图1F所示为各组支架的水接触角测试结果，利用Image J 图像分析软件测得，纯PLGA支架的水接触角大于90°，为144.30±7.32°。而负载OGP的支架，其水接触角均有所减小，并显著小于purePLGA组（P＜0.01），0.1OGP@PLGA、0.2%OGP@PLGA以及0.4%OGP@PLGA的水接触角分别为74.09±5.21°、78.84±5.97°以及71.57±14.80°。

图1 支架微观形貌观察及水接触角Fig.1 SEM images of pure PLGA (A),0.1% OGP@PLGA (B),0.2% OGP@PLGA (C) and 0.4% OGP@PLGA (D)scaffolds.E:Distribution of fiber diameter.F:Water contact angle of each scaffold.**P＜0.01 vs pure PLGA.

2.2 OGP缓释研究

负载不同浓度OGP电纺PLGA支架的OGP释放曲线显示：0.4% OGP@PLGA，0.2% OGP@PLGA，0.1%OGP@PLGA三组样品10 d内OGP的累计释放量分别是（68.5±3.2）%，（55.3±4.7）%和（47.8±2.5）%。同时，负载了高浓度OGP的PLGA膜显示出更快的释放速率（图2）。

2.3 材料生物相容性

细胞染色结果显示：第1天，不同样品上绿色的活细胞密度十分接近，随着培养时间的增加，0.2%OGP@PLGA组和0.4%OGP@PLGA组上的绿色的活细胞密度明显要高于其余的两组，这在第7天尤为明显，相比于纯PLGA组和0.1%OGP@PLGA组上依然较为稀疏的细胞分布，0.2% OGP@PLGA 组和0.4%OGP@PLGA组上的细胞已经密集到有开始汇聚融合的趋势（图2A）。成骨细胞在不同支架上体外增殖的CCK-8检测结果（图3B）。第1天时，各组吸光值没有显著差异，都在0.15左右，经过4 d和7 d培养后，支架上的吸光值有着不同程度的上升，其中，0.2%OGP@PLGA和0.4%OGP@PLGA组的吸光度在第4天和第7天的吸光度都要显著高于对照组PLGA（P＜0.01），并且0.4%OGP@PLGA组有着最高的吸光度。

图2 OGP累计释放曲线Fig.2 Cumulative release of OGP from the scaffolds in 10 days.

图3 生物相容性评估Fig.3 Biocompatibility evaluation of the scaffolds.A:Live and dead fluorescence images(Original magnification:×40).B:CCK-8 assay of rBMSCs cultured on pure PLGA,0.1%OGP@PLGA,0.2%OGP@PLGA and 0.4%OGP@PLGA at 1,4,and 7 days after cell seeding.**P＜0.01 vs pure PLGA.

第3天时rBMSCs在不同PLGA支架上的黏附情况显示：rBMSCs较为均匀地分布在支架上，细胞骨架均匀舒展开来，能隐约观察到细丝状的肌动蛋白，伪足紧紧黏附在支架表面，染色明显（图4）。

2.4 ALP活性表达和ARS染色

rBMSCs的ALP活性表达随着培养时间的增加而上升，但是无论是在第7天还是第14天，我们可以发现纯PLGA组上的细胞所表达的ALP活性最低，而0.4%OGP@PLGA组上的细胞ALP活性表达量最高，在第14天达到最大值，具有显著性差异（P＜0.01，图5B）。

分别在成骨诱导分化后的第7天和第14天对4组样品进行茜素红染色（图5A）。可见纯PLGA组基本上观察不到红色的矿化结节。随着培养时间增加，负载了OGP的PLGA纤维膜上，矿化结节的数目明显增多，并且其含量与PLGA中OGP的含量成正比，第14天时，负载0.4%的PLGA纤维膜上红色结节数目最多，且有连成一片的趋势。

图5 体外支架促成骨分化评估Fig.5 Evaluation of the osteoinduction ability of the scaffolds in vitro. A,B:ARS images and ALP activity at 7 and 14 days after cell seeding during osteogenic induction.**P＜0.01 vs pure PLGA;##P＜0.01 vs 0.1% OGP@PLGA;&&P＜0.01 vs 0.2%OGP@PLGA.

2.5 Micro-CT检测

进一步在体内表征OGP@PLGA支架对大鼠颅骨缺损的修复情况，考虑到动物福利及伦理，只选取0.4%OGP@PLGA组作为实验组。术后8周大鼠颅骨缺损部位的三维重构图显示0.4%OGP@PLGA组的修复效果最好（图6A），Micro-CT 软件分析发现（图6B），经0.4%OGP@PLGA组处理后，大鼠颅骨缺损处的新生骨量要显著多于其他两组（P＜0.01）。

图6 体内支架成骨分化评估Fig.6 Micro-CT analysis(A)and new bone volume(B)in the cranial bone defect area after 8 weeks of treatment.**P＜0.01vs control;##P＜0.01vs pure PLGA.

2.6 组织学结果

组织学染色结果显示：8周以后，细胞已经开始渗入植入的PLGA和0.4%OGP@PLGA材料内部，并且0.4%OGP@PLGA组中可以发现更多的新生组织。根据Masson染色，我们确定了0.4%OGP@PLGA组内有更多的新生骨小梁结构和胶原沉着（图7）。

图7 颅骨缺损部位HE和Masson组织切片染色Fig.7 HE staining and Masson staining of the cranial bone defect at 8 weeks in 3 groups.

3 讨论

本研究的主要目的是制备一种能促进骨缺损修复的骨组织工程支架，评估其临床应用前景。已有大量研究表明，细胞外基质（ECM）在细胞的生长，分化，潜移中具有重要作用［16,17］，ECM仿生支架能促进组织再生。因此理想的组织工程支架，其理化性质应当尽可能地与细胞外基质（ECM）相类似，从而为缺损部位的骨相关细胞提供一个良好的微环境，来加速骨组织的再生修复。在本研究中，我们设计负载了OGP 的PLGA 纤维支架。作为一种多肽，OGP在骨骼的重构再生中起着关键性的作用，并且不像TGF-β1等生长因子一样容易失活［18］。我们期望该支架一方面能模仿ECM的纤维结构，另一方面将OGP复合可以提高该支架的生物活性，同时OGP作为活性因子调控加速组织修复。

静电纺丝制备的纤维时常会受到纺丝液组分，电压以及纺丝环境湿度等影响［19-21］。OGP是一种小分子多肽，其时常被用于通过物理吸附的方法来改善材料的成骨活性。在本实验中，我们发现通过静电纺丝复合的OGP@PLGA纤维支架的形貌没有明显变化，各组的纤维直径分布较为均匀，无显著性差异。负载了OGP的PLGA静电纺丝支架完整地保留了其纤维结构，这种高比表面积的结构十分有利于组织再生，它能为细胞提供充裕的黏附空间，并且也利于物质代谢交换［15］。同时，由于其OGP结构中存在大量羧基以及羟基，接触角实验结果表明复合OGP的PLGA系列支架的亲水性显著低于纯PLGA组（P＜0.01），由疏水性表面转变为更适于细胞黏附增殖的亲水性表面，这与先前文献中报道的相类似，Liu等发现修饰了OGP的PLA支架其亲水性有了显著性提高［22］。同时，我们还发现静电纺OGP@PLGA支架能缓释OGP长达10 d以上，并且在第1天有显著的突释现象，这一现象可能是由于亲水性OGP在疏水性PLGA材料中的快速扩散所导致的［23］。

对于生物材料来说，良好的生物相容性是其具备应用价值的首要条件。本实验中我们选择了rBMSCs来体外验证负载OGP 的PLGA 纤维膜的生物相容性，rBMSCs作为一种干细胞后期能诱导分化为成骨细胞，是骨组织工程实验中最常用的种子细胞之一［24,25］。以纯PLGA支架为对照组，综合活死细胞染色，细胞增殖实验以及细胞形态表征实验的结果，我们发现通过电纺的方式将OGP掺入没有影响PLGA纤维支架的生物相容性，并且在一定程度上能赋予PLGA材料更优异的生物相容性，这在0.2%OGP@PLGA 和0.4%OGP@PLGA两组的实验结果上最为明显，依据活死细胞染色结果，该两组纤维膜支架材料上的rBMSCs不仅没有出现死亡的情况，其活细胞密度还更高，活死细胞染色结果也被CCK-8 细胞增殖实验结果证实，0.4%OGP@PLGA组有着最高的吸光值，说明该支架上的细胞有着最高的增殖率，具有最优异的生物相容性。这可能是由PLGA纤维支架中缓释出的适量OGP所导致的。该结果与之前的报道类似，Hou等［26］发现接枝在材料上的OGP能显著促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖。Saska等［11］也观察到了类似的结果，他们将纤维素/胶原/羟基磷灰石复合支架浸泡在含有OGP的溶液一段时间后，发现吸附了OGP的复合支架能显著提高骨细胞的增殖速率。

ALP是一种典型的早期成骨分化标志物，同时，在成骨分化后期，骨细胞本身及周围会沉淀大量钙结节［27］。因此，ALP活性检测以及ARS染色是两种常用的评估干细胞成骨分化水平的方法。前Saska发现［10］，生长在含有OGP的胶原-细菌纤维素膜上MC-3T3E1细胞其ALP活性以及钙结节分泌程度要明显高于种植在胶原-纤维素膜上的细胞。本研究中，我们得到了相近的结果，相比于纯PLGA 支架，负载0.4% OGP 的PLGA纤维支架能显著促进rBMSCs的ALP水平表达以及ARS染色深度，表明了0.4%OGP@PLGA支架具有更优异的成骨诱导能力。已有研究表明，OGP作为局部骨髓损伤全身成骨反应机制中的一个关键角色，不仅能刺激成骨细胞的增殖，而且能通过一种自我调节的反馈机制，来促进成骨分化［28,29］。在本研究中，OGP加入PLGA支架后，可以维持局部释放，从而促进rBMSC的增殖和成骨分化。最后，我们在体内实验中验证了0.4%OGP@PLGA纤维膜可以促进颅骨缺损修复，表明负载有OGP的PLGA电纺膜是一种很有前途的骨组织工程支架。

综上所述，在本研究中，我们首先通过了静电纺丝的方法制备得到含有不同含量OGP的PLGA纤维支架，该系列OGP@PLGA支架均具有类似ECM的结构，且能缓释支架中的OGP长达10 d，随后的体外生物相容性实验和成骨诱导分化实验结果表明，0.4%OGP@PLGA具有最优异的生物相容性和促成骨分化能力，同时，进一步的体内颅骨修复实验结果表明0.4%OGP@PLGA支架的修复效果要远远优于纯PLGA组及空白组，是一种潜在的理想骨组织工程支架，有望在临床上得到应用。虽然负载有OGP的材料膜在促进骨缺损修复方面取得了积极的结果，但我们的研究仍然存在一些局限性，例如，本研究中所使用的是颅骨缺损模型，其成骨机制是膜内成骨，与股骨、肋骨等长骨的骨发生机制有所不同，后者是基于软骨的骨化机制［30］，因此本研究可能无法完全模拟临床上常见的大段骨缺损的再生效果。除此之外，对于体内实验结果我们也未能进一步的论证，诸如通过免疫组化染色和蛋白免疫印迹来分析0.4%OGP@PLGA支架是通过怎样的分子机制来加速骨修复过程的，这也是我们后续进行深入研究的方向之一。