肺囊性纤维化一家系基因突变分析

李梁珊,郭依侠,刘世国,王丽娜

(青岛大学附属医院,山东 青岛 266003 1 医学遗传科； 2 产前诊断中心； 3 儿童保健科； 4 呼吸与危重症医学科)

囊性纤维化(CF)是一种白种人较常见的常染色体隐性单基因遗传病，常累及肺、胰腺、肝脏、胃肠道及生殖系统等多器官系统[1]，肺部病变是CF病人主要的死亡原因[2]。其临床特征具有异质性，主要的临床表现为咳嗽、咳痰、气管重塑、黏液堆积、胰腺功能不全、营养不良、汗液电解质异常升高、男性不育等[3-5]，有的病人还会出现其他并发症，如糖尿病、鼻窦炎、慢性代谢性碱中毒、肝大和肝硬化等表现[6-7]。CF病人诊断根据是典型的临床表现、CF家族史、汗液试验和基因突变检测结果等。

囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)是目前已知的CF致病基因，定位于Chr7q31.2，长188 kb，它含有27个外显子，编码含有1 480个氨基酸的CFTR蛋白。自RIORDAN[8]在1989年发现该基因以来，CFTR基因的结构、功能和突变对蛋白的影响已经得到了深入研究。CFTR是一种环磷酸腺苷(cAMP)依赖的氯离子通道蛋白[9]，控制氯离子和碳酸氢盐离子进出细胞[10]，表达于气道、肺、消化道和生殖道等多部位上皮细胞的顶膜[11]。CFTR缺失或功能障碍可导致氯离子转运功能异常、钠离子通道调节受损，使得阴离子分泌减少，钠离子和水重吸收增加，导致汗液和黏性分泌物中盐离子浓度增加，分泌物黏稠，从而堵塞不同的器官系统[7,12]。至今已有2 000多个CFTR基因突变被报道[11]，但是CF基因型和表型之间的关系仍然不够明确，有待进一步研究。

作为一种高通量的基因测序技术，全外显子测序(WES)具有成本效益高、准确性较高、测序时间短等优势，现已成为临床上诊断单基因遗传病的重要辅助手段。本研究报告一个肺囊性纤维化(PCF)家系，因家系比较小，临床表现单一，父母均未出现相似症状，很难对先证者做出准确诊断并判断可疑致病基因，所以本研究联合采用WES和Sanger测序验证技术筛查并确定可疑致病基因突变位点，探讨疾病基因型和表型的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象

病儿，女，8岁。3年前因反复咳嗽入院治疗。病儿反复咳嗽，活动后加重，有痰不易咳出，无咯血，无发热，支气管镜见大量白色黏痰，无胰腺、肠道、汗腺、肝脏及鼻窦等其他外分泌腺异常表现。既往有卵圆孔未闭史和哮喘史。体格检查：神志清，口唇无发绀，双肺呼吸音粗，未闻及哮鸣音，双下肺闻及少许湿啰音，心律齐，无双下肢水肿。行基因检测后确诊为PCF。病儿无兄弟姐妹，父母既往体健，无明显PCF症状，否认家族遗传史。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会审核批准。

1.2 研究方法

1.2.1外周血DNA提取 获得家系各成员的书面知情同意后，采集先证者及其父母的外周静脉血各3 mL，同时采集200例来自山东的健康对照者外周静脉血各3 mL。采用Tiangen DNA提取试剂盒提取外周血全基因组DNA，严格按照说明书要求进行操作。

1.2.2WES 将基因组DNA用超声波随机打断成长度为180～280 bp的片段，向纯化后的DNA片段中加入末端补齐体系和多聚核苷酸激酶(PNK)进行末端修复反应，经过Agencourt AMpure XP磁珠纯化，得到5′端含有磷酸基团的平末端DNA短片段文库。在已修复DNA片段的3′末端加上A碱基，并将Illumina测序接头连接至文库DNA两端。行PCR反应有效富集两端都连有接头的DNA片段。使用Agilent SureSelect Human All Exon V6试剂盒进行全外显子杂交捕获，从而捕获到基因的外显子，然后应用PCR扩增外显子DNA文库。完成桥式PCR之后，利用Illumina平台PE150(Pair end 150 bp)上机测序，目标区平均深度为111.360，目标区覆盖度为99.90%，并应用生物信息专业软件分析测序数据。与1 000 genomes、dbSNP数据库中人类基因组参考序列进行比对，寻找可疑的基因突变位点。

1.2.3Sanger测序验证 将WES筛查到的可疑致病突变在先证者及其父母和200例健康对照者中进行Sanger测序验证。对突变位点所在外显子序列进行PCR扩增，用Primer premier 5软件设计引物。PCR反应体系为20 μL，包括Master Mix 10 μL，上游、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min。扩增完成后，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，若条带明亮且单一，则使用ABI3730XL测序仪(Applied Biosystems)对PCR产物进行测序。与NCBI(National Center Biotechnology Information)网站上的标准序列进行比对，找出突变位点。

2 结 果

2.1 遗传学分析

WES遗传学分析表明，先证者存在两处错义突变(c.650A>G/p.Glu217Gly和c.1231A>G/Lys411Glu)分别位于CFTR基因的第6外显子和第10外显子，c.650A>G导致217位的谷氨酸变成甘氨酸，c.1231A>G导致赖氨酸在411位变成谷氨酸。Sanger测序验证表明，母亲存在一处c.650A>G/p.Glu217Gly杂合突变，父亲则是c.1231A>G/Lys411Glu杂合子携带者，先证者的两处复合杂合突变分别来自父亲和母亲。这两处突变均未在200例健康对照个体中检测到，表明变异在该家族中存在共分离现象。见图1。查阅相关文献和数据库，先证者的复合杂合突变在国内系首次报道。

2.2 生物信息学分析

从NCBI网站中获得人、牛、狗、家猫、小家鼠、兔、黑猩猩、猪的CFTR蛋白序列，并用DNAMAN软件进行多重序列比对。生物信息学的分析结果显示，突变c.650A>G位于CFTR蛋白的非保守序列中(图2A)，而突变c.1231A>G位于CFTR蛋白的高度保守区域(图2 B)。

3 讨 论

CF是由CFTR基因突变导致的一种外分泌腺功能异常的常染色体隐性遗传病，可累及全身多个器官系统，预后不良。该病以肺部持续炎症和反复感染、生长发育迟缓、脂肪和蛋白质吸收不良、不孕不育、慢性肝病等为主要特征[5-6,12-13]，其中肺和气道表现是CF最显著的临床表现[10]。

本研究通过WES结合Sanger测序验证的方法，在PCF病人CFTR基因的第6外显子和第10外显子发现了两处复合杂合突变(c.650A>G/p.Glu217Gly和c.1231A>G/Lys411Glu)，而在200例健康对照者中均未发现这两处突变，突变位点在该家系中共分离。LEE[14]研究证实，Glu217Gly突变降低了膜蛋白表达和阴离子转运活性的60%～70%，而Lys411Glu突变被NAKANO等[15]预测为有害变异。虽然这两个突变均曾被论述过对蛋白质的结构和功能有较大的影响，但由于本研究未行功能学验证，因此只能认为这两处突变是先证者PCF的高度可疑致病突变。

CFTR基因位于Chr7q31.2的长臂上，由27个外显子组成，全长约188 kb，在上皮细胞表面表达，编码由1 480个氨基酸组成的CFTR蛋白(氯离子通道蛋白)。CFTR蛋白是ATP结合盒(ABC)转运蛋白超家族中的一员，由5个结构域组成：包括2个跨膜结构域TMD1/TMD2、1个调控域R(为磷酸化位点)和2个核苷酸结构域NBD1/NBD2[4,10,16]。CFTR蛋白可以促使氯离子通过黏液产生于上皮细胞的顶膜，但是CFTR突变会影响该蛋白的合成和功能，导致上皮细胞对氯离子的通透性降低、钠离子重吸收增加，造成黏液黏稠和汗液氯离子浓度异常增高，厚厚的黏液在不同的器官中堆积，使黏液腺导管堵塞，进而引起外分泌腺功能障碍[7,14]。

根据CFTR的截断或缺乏、结构和功能，CFTR突变可分为6大类。Ⅰ类突变是由于移码突变或错义突变出现新的终止密码子，影响蛋白的生物合成，产生缩短的功能缺陷的CFTR[7,17]。Ⅱ类突变导致CFTR折叠或成熟障碍，致使缺陷的CFTR在内质网被提前降解而不能被运输至顶膜处[4]，其中最常见的突变是F508del[7,18]。Ⅲ类突变改变CFTR的调节，导致蛋白活性降低，使CFTR与ATP结合不能正常进行，从而影响通道的激活[17]。Ⅳ类突变导致蛋白传导异常。CFTR通道能打开及关闭，但是由于电传导缺陷，导致氯离子的转运功能降低[18]。Ⅴ类突变是RNA剪接异常，使功能正常的CFTR数量减少[16,19]。Ⅵ类突变导致CFTR蛋白的C-末端异常，影响成熟蛋白的稳定性，但CFTR的功能和数量均正常[7,9]。因未进行进一步的蛋白功能学验证，故不能证实本研究发现的两处错义突变属于哪一类CFTR突变。

总之，CF是一种累及多系统的复杂疾病，具有临床异质性，在中国的发病率很低，对该病进行准确诊断还需借助基因测序技术。随着技术的发展，具有准确、高通量、性价比高等特点的WES在单基因遗传病的检测和诊断中取得了丰硕的成果，可为遗传病的明确诊断、个体化治疗、遗传咨询和产前筛查等提供依据，具有广阔的临床应用前景。本研究结果不仅为CF的临床诊断和产前筛查提供了依据，也为CF致病机制和治疗方案的进一步研究奠定了坚实的基础。