利用LC-MS/MS辅助优化GICA对硝基呋喃类代谢物的快速检测

卢义博，余海霞，张小军，严忠雍，伦丽丽，王瑞瑞

(1.浙江海洋大学水产学院，浙江 舟山 316021；2.浙江省海洋水产研究所，浙江 舟山 316021；3.浙江大学舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316021；4.江苏美正生物科技有限公司，浙江 无锡 214135)

硝基呋喃类药物是一类广谱抗生素，具有5-硝基基本结构，通过影响细菌体内的氧化还原酶体系，干扰细菌正常代谢，曾普遍应用于水产养殖、畜牧业和其他养殖行业中疾病的预防和治疗[1-2]。研究表明，硝基呋喃类药物对动物具有“三致”毒性，并对人体具有致畸胎作用，且能诱发癌症[3]。因此，1995年欧盟禁止将其应用于食品中，并将其归类为A类禁用药物[4-5]。原农业部于2002年发布193公告，规定所有食品动物中禁止检出硝基呋喃类抗生素药物。

硝基呋喃类药物主要包含呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因4种，在动物体内代谢迅速，大约数小时，但是该类药物的代谢产物3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)及1-氨基-2内酰脲 (AHD)能够与膜蛋白键结合形成稳定态，可以长期保持稳定[6-7]。因此，检测4种硝基呋喃类代谢物残留可以更准确、直观的反映硝基呋喃类抗生素的使用情况。

目前硝基呋喃类代谢药物残留的主要检测方法有酶联免疫法(ELISA)[8-9]、胶体金免疫层析法(GICA)[10-11]、高效液相色谱法(HPLC)[12-13]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[14-18]等。ELISA虽特异性强，但反应耗时长，操作过程中易受温度干扰。HPLC、LC-MS/MS具有灵敏度高、检出限低、特异性强的优点，但存在仪器昂贵、前处理时间较长、操作方法复杂的缺点。GICA的原理是以硝酸纤维素膜为固相载体，以胶体金作为示踪标记物，与抗体结合，在微孔膜的渗滤作用或毛细管作用下，利用抗原抗体反应的高度特异性和胶体金特有的颜色对金标抗体与抗原或二抗的结合进行示踪，显示肉眼可见的红色条带或斑点，从而实现对待测物的定性分析[19]。因此胶体金技术具有方便快捷、不需要特殊设备和结果判断直观等优点。但同时该方法受抗原和胶体金的稳定性及灵敏度的影响，易被不同样本基质和检测溶液中杂质干扰，从而影响结果的判断。针对硝基呋喃类代谢物的快速检测方法存在的缺陷，有必要对硝基呋喃类代谢物GICA方法进行优化。

硝基呋喃类代谢物样本基质差异明显，实际阳性样本中硝基呋喃类代谢物以结合态形式存在，而阴性加标样品以游离态形式存在，所以2种基质样本在同一前处理条件下结果相差较大。针对硝基呋喃类代谢物的GICA的检测方法存在的缺陷，本实验选择不同基质样品进行水解和衍生化，采用外标法，由LC-MS/MS准确定量，同时采用原农业部783公告方法测定样本含量，2种数据换算以回收率作为参考指标，优化GICA的前处理，提高检测的准确率。

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

ACQUITY高效液相色谱-质谱仪 Quattro Premier XE(美国Waters公司)；T18匀浆机、MS2漩涡混合器(德国IKA公司)；N-EVAP-112氮吹仪(美国Organomation公司)；Centrifuge 5810高速离心机(德国Eppendorf公司)；HH-S11数显恒温水浴锅(金坛市精达仪器制造公司)。

盐酸、磷酸氢二钾(分析纯，上海国药集团)；甲醇、二甲基亚砜、2-硝基苯甲醛、醋酸乙酯等(色谱纯，美国Sigma公司)，硝基呋喃类代谢物标准品及其内标物：AOZ、SEM-HC1、AHD-HC1、AMOZ、AOZ-D4、SCA-HCL-13C-15N2、AHD-HCL-13C3、AMOZ-D5(纯度均≥98%，美国Sigma公司)；呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因及呋喃西林代谢物胶体金快速检测试纸条(江苏美正生物科技有限公司)。

1.2 标准溶液的配制及不同样品的制备

准确称取(5.00± 0.01)mg AOZ、SEM、AHD、AMOZ(SEM和AHD的质量为SEM-HC1和AHD-HC1去除盐酸后换算的质量)用甲醇溶解定容于50 mL容量瓶，4 ℃避光保存，保存期限为6个月；使用时逐级稀释至100 ng/mL。

阳性样品：经原农业部783号公告—1—2006方法确证的两份鲫(Carassiusauratus)样本，其中一份AOZ含量为2.82 μg/kg，另一份SEM含量为2.32 μg/kg。

模拟阳性样品：经原农业部783号公告方法确证的阴性鲫样本，称取250 g样本2份，分别添加1 μg/mL AOZ 600 μL和1 μg/mL SEM 600 μL，充分涡旋搅拌均匀，随机从两份样本中取3份样品采用原农业部783号公告方法检测其浓度。冷冻48 h，取出后充分解冻，重复抽取两份样本各3份样品采用原农业部783号公告方法检测其浓度。最终确定AOZ为2.28 μg/kg、SEM为2.07 μg/kg。

1.3 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；色谱柱温度：40 ℃；样品室温度：10 ℃；进样量：10 μL；流速：0.2 mL/min；流动相A：含0.1%甲酸的2 mmol/L醋酸铵溶液，B：甲醇；梯度洗脱条件如下：0～3 min,90%～40% A;3～5 min,40%～90% A;5～6 min,A保持90%不变。

1.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(Electorspray ionization，ESI)，正离子模式扫描；检测方式：多反应监测模式(Multiple reaction monitoring，MRM)；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：120 ℃；脱溶剂气温度：380 ℃；脱溶剂气流量：600 L/h；锥孔气流量：50 L/h；锥孔电压和碰撞能量等质谱多反应监测实验条件见表1。

表1 硝基呋喃类代谢物的质谱检测参数Tab.1 Mass spectrometric detection parameters of nitrofuran metabolites

1.5 样品处理

准确称取样品2.00 g(精确到0.01 g)于50 mL离心管中，再加入5 mL 0.35 mol/L 盐酸溶液和0.35 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，涡旋振荡50 s后，置于90 ℃水浴锅衍生120 min。取出冷却恢复至常温后加入磷酸氢二钾溶液使pH至7.0左右，加入8 mL乙酸乙酯，涡旋振荡120 s，6 000 r/min离心5 min，取上层清液转移至15 mL离心管；上清液于60 ℃氮气吹干。添加1 mL初始流动相(复溶液)和2 mL正己烷涡旋振荡溶解残留物，取下层(过膜)待测。

1.6 UPLC-MS/MS方法测定

取下层溶液过滤0.22 μm尼龙微孔滤膜，按照上述实验条件进行仪器定量检测分析。

1.7 GICA方法判定

将所需数量的试剂条和微孔试剂恢复至常温(20～25 ℃)并做好标记；用微量移液器移取下层澄清待测液100 μL于微孔试剂中混合均匀，室温下孵育2 min；将试剂条浸润微孔试剂混合液，室温下反应3 min后且在5 min之内判定结果。

1.8 方法优化和样品验证

对于胶体金免疫层析法来说，其结果定性判定为阳性、阴性或无效，在优化实验中无法准确定量实验数据。4种硝基呋喃类代谢物中最常见的检出物质为AOZ和SEM，AMOZ和AHD在日常实验室检测中几乎均未检出，因此本实验选择AOZ、SEM做为主要考察对象。实验首先将实际阳性样品和模拟阳性样品采用原农业部783号公告方法进行定量分析，其次选择不同的实验条件对两种不同基质样品进行比对分析，采用LC-MS/MS检测，外标法定量，每组进行3次平行试验，最后将2种方法的检测数据进行处理，以AOZ、SEM的回收率为参考指标，进行优化分析。

图1 GICA结果判定示意图阴性(-)：T线(Test线)与C线(Control线)颜色一致或者较浅，表明样品中的待检测物质低于检测限量或者不含待检测物质。阳性(+)：T线比C线颜色较浅或T线不显色，表明样品中待检测物质高于检测限量。无效：仅T线显色或者T线、C线均不显色，表明实验失败或试剂条失效，需重新进行实验。Fig.1 Schematic diagram of GICA result judgmentNegative (-):the color of T line and C line is consistent or lighter,indicating that the substance to be detected in the sample is lower than the detection limit or does not contain the substance to be detected.Positive (+):the color of T-line is lighter than that of c-line or T-line does not show color,indicating that the substance to be detected in the sample is higher than the detection limit.Invalid:only t line develops color or T line and C line do not develop color,indicating that the experiment fails or the reagent strip is invalid,so it is necessary to conduct the experiment again.

1.8.1 样品水解浓度的选择

目前国标[20-21]和原农业部[22]的实验方法均是在酸性条件下进行水解，实验选择不同浓度的盐酸比较不同样品水解程度。研究了盐酸浓度分别为 0.20、0.25、0.30、0.35及0.40 mol/L对AOZ和SEM回收率的影响。

1.8.2 衍生化试剂体积的选择

不同的衍生试剂及其使用量会影响衍生反应的速度。在未使用同位素内标的情况下，综合比较参考文献[15-16]，选取不同体积的0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛为衍生试剂，在酸性条件下，可对4种硝基呋喃类代谢物进行快速衍生化。

1.8.3 衍生温度和时间的优化

衍生温度和时间在衍生化反应中发挥着重要作用，实验考察了衍生温度分别在40、50、60、70、80及90 ℃条件下衍生时间为30、60、90、120及180 min时不同基质样本的回收率。

1.8.4 检出限的确定

从市场上采集的鲫、草鱼(Ctenopharyngodonidella)、南美白对虾(LitopenaeusVannamei)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)按照SC/T 3016—2004《水产品抽样方法》的规定处理后于-18 ℃密封保存。鱼肉去皮，虾、蟹去壳，切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块后混匀，充分匀浆，使用前充分解冻。

称取鲫、草鱼、南美白对虾、三疣梭子蟹样本2.00 g，分别添加0.25、0.50、1.00 μg/kg 4种硝基呋喃类代谢物混合标准品，每组进行5次平行试验，样品经过最佳条件下的前处理后，分别对4种硝基呋喃类代谢物的试纸条进行测定分析。

1.8.5 实际样品分析

本实验采购浙江省金华市日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)20批次，浙江省舟山市鲫20批次，浙江省温州市泥蚶(Tegillarcagranosa)20批次，江苏省淮安市克氏原螯虾(Procambarusclarkii)20批次、海南省南美白对虾20批次，山西省草鱼20批次，浙江舟山东河市场大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、海参(Stichopusjaponicus)、乌鳢(Channaargus)、鳗鱼(Anguillaanguilla)各5批次共计140批次样本进行实际水产品中4种硝基呋喃类代谢物的测定。

2 结果与分析

2.1 样品水解浓度的选择

从图2中可以看出，2种基质样品在不同盐酸浓度条件下回收率的变化，实际阳性样本的回收率在0.20～0.35 mol/L的盐酸浓度范围内，随着浓度的升高而升高，在0.35～0.40 mol/L的浓度范围内，随着浓度的升高回收率出现较小波动，变化差异不明显。阴性加标样品的回收率在0.20～0.40 mol/L的盐酸浓度范围内，AOZ和SEM的回收率均在75.00%～80.00%，且无显著变化。通过对不同样品的回收率分析，在0.20～0.40 mol/L的盐酸浓度范围内，当盐酸浓度为0.35 mol/L时，AOZ、SEM的回收率最高。

图2 不同浓度盐酸水解对不同基质样品AOZ(A)和SEM(B)回收率的影响Fig.2 Effect of hydrochloric acid hydrolysis concentrations on the recoveries of different matrix samples AOZ(A)and SEM(B)

2.2 衍生化试剂体积选择

实验考察了4种不同体积的2-硝基苯甲醛溶液对不同基质样本的影响，结果如图3所示。随着衍生化试剂体积的逐渐增加，阳性样品的回收率先升高后趋于稳定，当衍生化试剂体积为0.35 mL时，回收率达到最高。而阴性加标样品的回收率在不同衍生试剂体积范围内，无明显差异变化。

图3 不同体积的衍生化试剂对不同基质样本AOZ(A)和SEM(B)回收率的影响Fig.3 Effect of derivatization reagents with different volumes on the recoveries of different matrix samples AOZ(A)and SEM(B)

2.3 衍生温度和时间的优化

不同衍生温度和时间对模拟阳性样本和实际阳性样本回收率的影响结果如图4、图5所示。

图4 不同衍生温度和时间对模拟阳性样品(A)AOZ和(B)SEM回收率的影响Fig.4 Effect of different derivatization temperature and time on the recoveries of AOZ (A)and SEM (B)in simulated positive samples

对阴性加标样品实验结果表明，不同的衍生温度和时间条件下，回收率不随着温度和时间的变化而变化。

从图5可以看出，实际阳性样本的回收率在不同衍生温度和时间的变化。在40～70 ℃的衍生温度范围内，对于同一温度来说，在30～180 min的衍生时间内，回收率随着时间的增加而增加。在80～90 ℃的衍生温度范围内，对于同一温度来说，回收率在30～120 min的衍生时间内，随着时间的增加而增加；回收率在120～180 min的衍生时间内，回收率无明显改变。通过对实际阳性样本回收率的分析，考虑前处理操作时间，最终选择衍生温度和时间分别为90 ℃和120 min。

图5 不同衍生温度和时间对实际阳性样品(A)AOZ和(B)SEM回收率的影响Fig.5 Effect of different derivatization temperature and time on the recoveries of AOZ (A)and SEM (B)in real positive samples

实验以不同基质的样品为研究对象，使用LC-MS/MS对反应结果精准定量，得到最佳的反应条件：盐酸浓度0.35 mol/L，0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛0.35 mL，水浴温度90 ℃，时间120 min。

2.4 检出限的确定

实验结果如表2所示。结果表明，4种代谢物检出限均为0.50 μg/kg，且重复性好，能够满足日常快速筛查要求。

表2 不同基质样品的加标验证Tab.2 Validation of different matrix samples n=5

2.5 实际样品验证

实验检测结果显示有12批次阳性样品，其中10个呋喃西林代谢物胶体金试条显示阳性，另外2个呋喃唑酮代谢物胶体金试纸条显示阳性。将140批次样本通过原农业部783号公告—1—2006方法进行确证，具体结果如表3所示。其中12批次样本经仪器确证均分别含有呋喃西林代谢物、呋喃唑酮代谢物，检测结果与快速检测方法的结果相符合。实验结果表明，该方法假阳性和假阴性率均为0，实验数据准确可靠。

表3 实际样品验证的检测结果Tab.3 Test results of real samples n=5

3 结论

本实验通过LC-MS/MS精准定量的优势优化GICA前处理方法，得到最佳反应条件：盐酸浓度0.35 mol/L，0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛0.35 mL，水浴温度90 ℃，水浴时间120 min。本方法能够满足胶体金快速检测需要，4种硝基呋喃类代谢物检出限均为0.50 μg/kg，灵敏度高，前处理简便快捷，并且通过LC-MS/MS方法的验证，确保了实验结果的准确性。同时利用本方法对140批次不同基质的实际样品进行GICA检测，实际结果检测得出12批次阳性样品，用原农业部783号公告的方法对140批次样品进行验证，结果与GICA检测结果相符合。本方法大幅缩短前处理损耗的时间，准确性高，适合于企业和检测机构大批量的初步筛查。