酶联免疫检测在冰葡萄组培苗上的应用

王丹萍 曲 淼 杨殿静 赵殿辉 王洪伟

（通化市园艺研究所 吉林通化 134000）

葡萄是果树中感染病毒病最多的树种之一，种类多，分布广，危害大。现发现的葡萄病毒病20个属55种，我国鉴定明确的葡萄病毒总共有6种。北冰红冰葡萄发现有四种主要病毒，葡萄卷叶病毒（GLRaV）、葡萄花叶病（GCMV）、葡萄扇叶病毒（GFLV）、葡萄栓皮病毒（GCBD）。本试验通过酶联免疫检测手段筛选无病毒种苗，进而达到扩繁和工厂化生产北冰红脱毒苗的目的。

1 试验流程

通过人工观察筛选无病毒病表现优良单株（田间鉴定），扦插繁育少量种苗，取茎尖进行无病毒植株接种，将组培苗置入培养箱38℃高温脱毒培养，后进行酶联免疫吸附测定试剂检测病毒。

血清学检测葡萄病毒是目前检测植物病毒的重要技术之一。本试验利用美国NanD.LLC公司针对葡萄四种病毒的酶联免疫吸附测定试剂，采用三抗体夹心法，碱性磷酸酶结合进行酶联免疫吸附（ELTSA）测定。

1.1 试验材料

包被抗体、AP共轭A瓶、AP共轭B瓶、葡萄扇叶病毒（GFLV）正对照、葡萄扇叶病毒（GFLV）负对照、葡萄栓皮病毒（GCBD）正对照、葡萄栓皮病毒（GCBD）负对照、葡萄花叶病毒（GCMV）正对照、葡萄花叶病毒（GCMV）负对照、葡萄卷叶病毒（GLRaV）正对照、葡萄卷叶病毒（GLRaV）负对照、纳米诊断的ELISA测试的冻干对照、PNP底片、PNP板、测试板、培养皿、平底板、移液器、试管、冰箱、培养箱

1.2 制备所有缓冲液

缓冲液配方：①包被缓冲液：碳酸钠1.60g、碳酸氢钠2.92g、叠氮化钠0.2g溶于蒸馏水，定容至1000毫升，pH值调至9.6，4℃贮藏。②PBST缓冲液：二碱基磷酸钠1.15g、磷酸钾0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、吐温-20 0.5g溶于蒸馏水，定容至1000毫升，调节pH值至7.3。③SB1缓冲液：卵清蛋白粉2.0g、聚乙烯吡咯烷酮10.0g、亚硫酸钠1.3g、叠氮化钠0.2g、吐温-20 10.0g溶解在1000毫升1×PBST中。调节pH值至7.3，4℃贮藏。④ECB1缓冲液：牛血清白蛋白2.0g、聚乙烯吡咯烷酮10.0g、叠氮化钠0.2g在1000毫升1×PBXT中溶解。调节pH值至7.3，4℃贮藏。⑤PNP缓冲液：二乙醇胺97.0ml、氯化镁0.1g、叠氮化钠0.2g溶于800ml蒸馏水，pH值9.8，储存于4℃。

1.3 测试步骤

将浓缩的包被抗体按1∶200稀释到包被缓存液中。在玻璃容器中制备包被抗体。吸取100μ的包被抗体放入每个孔中。将包被板放潮湿的培养箱中放在（4℃）冰箱中一夜进行培养。在培养结束后，用PBST注满微孔来清洗包被板，重复6次。

选择9瓶不同植株培养的试管苗底部叶片组织用于酶联免疫吸附测试。清洗后，提取植物茎叶汁液，将汁液以1∶10（汁液量∶缓冲液量）的比例稀释到SB1样品提取缓冲液中。每微孔加100μl供测样本。

将100μl正对照和注入正对照微孔，将100μl负对照注入负对照微孔中。将被板放入潮湿箱中，在室温（21～24℃）下培养2.5小时。培养完成后，向微孔内注入PBST来清洗被板，重复6～8次。

所有的测试微孔中，每个微孔分配100μl共轭酶（加入10μlA瓶液体和10μlB瓶液体至ECB1缓冲液）。在室温（21～24℃）下，将被板放入潮湿的培养箱中培育2.5小时。

每孔分配100μl PNP底物溶液（浓度为1mg/ml）。室温（21～24℃）下，在潮湿的培养箱中对板培养60分钟。取出后每孔加入50μl 3M氢氧化钠中止反应。加入120μl纳米诊断的ELISA测试的对照液。

2 试验结果

测试结果可以用肉眼检查。测试孔中的颜色为黄色则表明阳性结果。微孔中没有显著颜色变化进展表明阴性结果。只有阳性对照孔呈现出阳性结果，阴性对照孔依然无变化，测试结果有效。

通过以上试验方法，分别对葡萄卷叶病毒（GLRaV）、葡萄花叶病（GCMV）、葡萄扇叶病毒（GFLV）、葡萄栓皮病毒（GCBD）进行了测试，结果均显示样本中未检测出相应病毒。

3 结论

使用酶联免疫检测的方法对随机抽样的样品进行测试表明，通过热处理和茎尖培养相结合的方法能够有效的抑制病毒，多次脱毒后可获得无病毒株，进而研究无细胞分裂素繁殖技术，脱毒苗是目前防治北冰红冰葡萄病毒病唯一技术手段，研发“北冰红”冰葡萄工厂化脱毒苗生产技术，提供优良种苗，提供绿色栽培技术，保证北冰红种植健康发展。