大珠母贝组织蛋白酶B基因克隆及其表达分析

徐扬 王姿曼 李俊辉 梁飞龙 邓岳文 杨创业

摘要：【目的】分析組织蛋白酶B基因（CatB）在大珠母贝（Pinctada maxima）不同组织中的表达模式，明确CatB在大珠母贝中的功能作用，为培育生长快且抗逆性强的大珠母贝提供基础资料。【方法】利用RACE克隆大珠母贝CatB基因，利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、NPS@SOPMA、SWISS-MODEL及SignalP 4.1等在线软件进行生物信息学分析，并以实时荧光定量PCR检测CatB基因在大珠母贝外套膜（套膜区、边缘膜区和中央膜区）、肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等组织中的表达情况。【结果】大珠母贝CatB基因cDNA序列全长1365 bp，其开放阅读框（ORF）1026 bp，5'非编码区（5'-UTR）长度81 bp，3'非编码区（3'-UTR）长度258 bp，共编码341个氨基酸残基。大珠母贝CatB蛋白分子量为37.73 kD，理论等电点（pI）为6.66，脂溶性系数为67.48，不稳定指数为31.18，亲水性平均系数（GRAVY）为-0.451，为稳定的亲水性蛋白;在第89～337位氨基酸存在一个Pept-C1结构域。大珠母贝CatB蛋白二级结构以无规则卷曲为主，占51.03%，α-螺旋占26.98%，β-转角占9.09%，延伸链占12.90%;三级结构与马氏珠母贝（P. fucata martensii）CatB蛋白结构相似。大珠母贝CatB氨基酸序列与马氏珠母贝CatB氨基酸序列（ADX32985.1）的相似性高达90.91%;与长牡蛎（Crassostrea gigas，XP_011428258.1）、海湾扇贝（Argopecten irradians，ANG56311.1）、褶纹冠蚌（Cristaria plicata，AEF32260.1）的CatB氨基酸序列相似性分别为79.47%、65.38%和62.18%。CatB基因在大珠母贝外套膜的套膜区、边缘膜区和中央膜区及肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等7个组织中均有表达，以肝胰腺中的相对表达量最高，显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.05），其次是外套膜的套膜区和中央膜区。【结论】CatB基因在大珠母贝肝胰腺中高表达，其次是外套膜的套膜区和中央膜区，故推测CatB是通过参与大珠母贝的消化吸收作用而调控其生长代谢过程。

关键词： 大珠母贝;组织蛋白酶B（CatB）;基因克隆;组织表达;肝胰腺;消化吸收

中图分类号： S968.316.3                             文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）05-1353-09

Abstract：【Objective】Analyzed the expression patterns of cathepsin B gene（CatB）in different tissues of Pinctada maxima， and clarified the functional role of CatB in P. maxima， in order to provide basic information for cultivating fast-growing and stress-resistant P. maxima. 【Method】The CatB gene in P. maxima（designated as PmCatB） was obtained by RACE with ExPASy ProtParam， ExPASy ProtScale， NPS@SOPMA， SWISS-MODEL and SignalP 4.1 online softwares for bioinformatics analysis and quantitative real-time PCR was used to detect the expression level of PmCatB in different tissues including the mantle（marginal zone of mantle，pallial zone of mantle and central zone of mantle）， hepatopancreas， gill， foot and adductor muscle. 【Result】The full length of PmCatB cDNA sequence was 1365 bp， with an open reading frame（ORF） of 1026 bp， 5' untranslated region （UTR） was 81 bp， 3'  UTR was 258 bp， and encoded 341 amino acids residues. The molecular weight of PmCatB protein was 37.73 kD and the theoretical isoelectric point（pI） was 6.6. The fat solubility coefficient was 67.48， the instability index was 31.18， and the average hydrophilicity coefficient（GRAVY） was -0.451， which was a stable hydrophilic protein; there was a Pept-C1 domain at amino acids 89-337. The secondary structure prediction of PmCatB protein showed that random coils were dominant， accounting for 51.03%， α-helix accounted for 26.98%， β-turn accounted for 9.09%， and extended strand accounted for 12.90%;the tertiary structure was similar to the CatB protein structure of P. fucata martensii. The similarity between the CatB amino acid sequence of P. maxima and the P. f. martensii（ADX32985.1） was as high as 90.91%;and the similarities of the amino acid sequence of the Crassostrea gigas（XP_011428258.1）， Argopecten irradians（ANG56311.1） and Cristaria plicata（AEF32260.1） compared with P. maximawere 79.47%， 65.38% and 62.18% respectively. PmCatB was expressed in tissues including the marginal zone of mantle， pallial zone of mantle， central zone of mantle， hepatopancreas， gill， foot and adductor muscle，  the relative expression in hepatopancreas was the highest， and the relative expression level wassignificantly higher than the relative expression in other tissues（P<0.05）， and followed with the marginal zone of the mantle and the central zone of the mantle. 【Conclusion】PmCatB shows high expression in the hepatopancreas，and followed by the pallial zone of mantle and central zone of mantle， so it is speculated that PmCatB may participate in the process of growth and metabolism process bytaking part in the digestion and absorption of P.maxima.

Key words： Pinctada maxima; cathepsin B（CatB）; gene cloning; tissue expression; hepatopancreas; digestion and absorption

Foundation item： National Shellfish Industrial Technique System Construction Project（CARS-049）; Innovation Team Project of Department of Education of Guangdong（2017KCXTD016）; Guangdong Shellfish Industrial Technique System Construction Project（2020KJ146）

0 引言

【研究意义】大珠母贝（Pinctada maxima）别名白蝶贝，隶属于软体动物门（Mollusca）双壳纲（Bivalvia）异柱目（Anisomyaria）珍珠贝科（Pteriidae）（唐仁生等，2009;王新星等，2016），是大型海产珍珠贝，其产生的珍珠规格大，经济价值高（谢绍河等，2013）。大珠母贝主要分布于澳大利亚和西太平洋沿岸，在我国主要分布在海南沿海及雷州半岛和西沙群岛沿岸海域（姜因萍和何毛贤，2009）。我国从20世纪70年代起开始研究大珠母贝的人工繁殖及珍珠培育，但大珠母贝产业在我国并未得到快速发展，其主要原因是人工繁殖的大珠母贝成活率低，大部分贝苗生长至3 cm左右就出现大批量死亡（梁飞龙等，2011）。因此，探究大珠母贝生长代谢调节机制对于促进大珠母贝培育及珍珠养殖具有重要意义。【前人研究进展】消化酶对生物体意义重大，主要通过影响机体的营养吸收而调控其生长发育，可分为淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶三大类（潘鲁青等，2006;姜爱兰等，2020）。组织蛋白酶B（Cathepsin B，CatB）是一种蛋白水解酶，属于木瓜蛋白酶超家族（Mort and Buttle，1997;Aggarwal and Sloane，2014），也是11种半胱氨酸蛋白酶之一，具有内切酶和二肽基羧肽酶活性（Khaket et al.，2019）。CatB首先在糙面内质网形成无活性的蛋白酶原，然后进入高尔基体进行糖基化和磷酸化形成甘露糖-6-磷酸蛋白;接着磷酸化蛋白与溶酶体中6-磷酸甘露糖受体结合，并运输至溶酶体内（McCormick，1993;Mort and Buttle，1997）。CatB与木瓜蛋白酶超家族的其他成员相似，其蛋白酶前体酶原包括3个组成部分：信号肽、前导肽和成熟蛋白酶（韩月，2019）。在动物体内，CatB以酶原形式存在于溶酶体中，能水解多种蛋白;CatB基因是调控动物生长发育的重要候选功能基因（李胜杰等，2018），在物种间高度保守且广泛分布（王晓梅，2008）。已有研究证实，CatB与多种人类疾病相关，具有抗肿瘤和抗癌症作用（Sloane et al.，2005），还能促进细胞凋亡（Podgorski and Sloane，2003）。在非哺乳动物中，CatB被认为是主要的消化酶，在北极虾（Pandalus borealis）（Aoki et al.，2003）、文昌鱼（Branchiostoma belcheri）（Wang et al.，2004）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）（郭慧等，2017）及皱褶冠蚌（Cristaria plicata）（Yi et al.，2018）中均有研究，且发现其在消化腺中大量表达，故推测其参与消化代谢调控。此外，有报道发现CatB参与鱼类和双壳类早期幼虫发育阶段的卵黄物质加工（Tingaud-Sequeira et al.，2011）。【本研究切入点】CatB是软体动物重要的消化酶，主要参与溶酶体蛋白降解（Aoki et al.，2003;王晓梅，2008），但有关CatB在大珠母贝中的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用RACE克隆大珠母贝CatB基因cDNA序列并进行生物信息学分析，通过实时荧光定量PCR检测CatB基因在大珠母贝不同组织中的表达模式，明确CatB在大珠母贝中的功能作用，为培育生长快且抗逆性强的大珠母贝提供基础资料。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试大珠母贝取自广东省湛江市徐闻县承梧村海区，挑选无病害的2龄大珠母贝，采集外套膜（套膜区、边缘膜区和中央膜区）、肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等组织样品，液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1. 2 总RNA提取及cDNA合成

通过TRIzol提取大珠母贝7个组织总RNA，使用1.0%琼脂糖凝胶电泳验证其完整性，运用NanoDrop ND1000紫外分光光度计分析其浓度和纯度。参照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit说明制备5'-RACE和3'-RACE模板;并参照Reverse Transcriptase M-MLV（RNaseH）说明合成cDNA模板，用于实时荧光定量PCR检测。

1. 3 CatB基因cDNA序列克隆

从大珠母贝转录组数据库中获取CatB基因的Unigene序列，并利用Primer Premier 5.0設计特异性引物（表1），采用巢式PCR分别扩增5'末端序列和3'末端序列，PCR扩增其中间片段。通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，经纯化回收试剂盒分离纯化的目的基因片段连接至pMD19-T载体后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，以含氨苄青霉素（Apm+）的LA培养基挑选阳性克隆菌株进行PCR检测，并将阳性克隆菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1. 4 生物信息学分析

使用DNAMAN对获得的5'末端序列、3'末端序列及中间片段进行拼接，得到大珠母贝CatB基因cDNA全长序列;采用NCBI中的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测大珠母贝CatB基因开放阅读框及其推导氨基酸序列;利用ExPASy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析其编码蛋白理化性质，采用ExPASy ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）预测其亲/疏水性;使用NPS @SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel. expasy.org/interactive）分别预测大珠母贝CatB蛋白的二、三级结构;运用SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）预测氨基酸信号肽;使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）进行氨基酸结构域分析;使用NCBI中的BLAST（http：//blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi）进行同源比对分析，并以MEGA 6.0构建系统发育进化树。

1. 5 大珠母贝CatB基因组织表达分析

采用实时荧光定量PCR检测CatB基因在大珠母贝外套膜（套膜区、边缘膜区和中央膜区）、肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等组织中的表达情况。以β-actin为内参基因，通过2-ΔΔCt法换算大珠母贝各组织中的CatB基因相对表达量（Livak and Schmittgen，2001），并利用SPSS 18.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 结果与分析

2. 1 大珠母贝CatB基因cDNA序列克隆及测序结果

RACE克隆获得大珠母贝CatB基因cDNA序列全长1365 bp，其开放阅读框（ORF）1026 bp，5'非编码区（5'-UTR）长度81 bp，3'非编码区（3'-UTR）长度258 bp，共编码341个氨基酸残基。大珠母贝CatB蛋白分子量为37.73 kD，理论等电点（pI）为6.66。

2. 2 大珠母贝CatB蛋白理化性质分析结果

ExPASy-ProtParam分析结果表明，大珠母贝CatB蛋白的脂溶性系数为67.48，不稳定指数为31.18，属于稳定蛋白;其亲水性平均系数（GRAVY） -0.451，为亲水性蛋白（图1）。从图2可知，大珠母贝CatB蛋白含有一个由14个氨基酸残基组成的信号肽。经SMART分析发现，大珠母贝CatB蛋白在第89～337位氨基酸存在一个Pept-C1结构域（图3）。大珠母贝CatB蛋白二级结构预测结果（图4）显示，以无规则卷曲占比最高，为51.03%，α-螺旋占26.98%，β-转角占9.09%，延伸链占12.90%。SWISS-MODEL预测发现，大珠母贝CatB蛋白的三级结构与马氏珠母贝（P. fucata martensii）CatB蛋白结构相似（图5）。

2. 3 CatB氨基酸序列同源比对分析及系统发育进化树构建

多序列比对分析结果（图6）表明，大珠母贝CatB氨基酸序列与马氏珠母贝CatB氨基酸序列（ADX32985.1）的相似性最高，为90.91%;与长牡蛎（Crassostrea gigas，XP_01142825 8.1）、海湾扇贝（Argopecten irradians，ANG56311.1）、褶纹冠蚌（Cristaria plicata，AEF32260.1）的CatB氨基酸序列相似性分别为79.47%、65.38%和62.18%，说明CatB蛋白为保守蛋白。基于CatB氨基酸序列相似性，构建大珠母贝与褶纹冠蚌、海湾扇贝、长牡蛎、马氏珠母贝、海绵（Suberites domuncula，CAH04630.1）、仿刺参（Apostichopus japonicus，AOG61243.1）、鸭嘴海豆芽（Lingula anatina，XP_013409929.1）、人类（Homo sapiens，NP_001371643.1）、果蝇（Drosophila melanogas，NP_001259536.2）、皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai，AGK85259.1）、福寿螺（Pomacea canaliculata，XP_005107685.1）及海蜗牛（Aplysia californica，XP_005107685.1）的系统发育进化树，结果（图7）显示大珠母贝与马氏珠母贝等软体动物聚为一支，其亲缘关系较近，而与人类及海蜗牛等物种相距较远。

2. 4 大珠母貝CatB基因的组织差异表达分析结果

从图8可看出，CatB基因在大珠母贝外套膜的套膜区、边缘膜区和中央膜区及肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等7个组织中均有表达，以在肝胰腺中的相对表达量最高，显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.05），其次是外套膜的套膜区和中央膜区，而在足和闭壳肌中的相对表达量较低。

3 讨论

组织蛋白酶在不同物种间具有较高的同源性，且广泛存在，在细胞内和细胞外的蛋白降解工程中均发挥重要作用（Donald et al.，2003）。本研究通过RACE克隆获得大珠母贝CatB基因cDNA序列全长1365 bp，其开放阅读框1026 bp，共编码341个氨基酸残基。大珠母贝CatB蛋白含有一个由14个氨基酸残基组成的信号肽，且在第89～337位氨基酸存在一个Pept-C1结构域，具有半胱氨酸蛋白酶活性，属于水解蛋白酶。CatB是半胱氨酸蛋白酶家族的典型代表（朱鹏等，2020），能利用半胱氨酸残基的巯基作为亲核试剂，而水解蛋白的肽键（Barrett and Rawlings，2001）。CatB在正常情况下参与细胞内溶酶体中的蛋白降解，其活性位点呈闭合环状结构，表现为外切酶活性;但在病理条件下，CatB参与溶酶体外的生理过程，并释放到细胞核内的中性环境中，闭合环状结构打开，表现出内切酶活性（黄媛等，2016）。多序列比对分析结果显示，CatB基因在不同物种间高度保守，其中大珠母贝CatB氨基酸序列与马氏珠母贝CatB氨基酸序列的相似性高达90.91%;基于CatB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示，大珠母贝与马氏珠母贝等软体动物聚为一支，其亲缘关系较近。

CatB在多种无脊椎动物中均有表达。在文蛤（Yao et al.，2011）、缢蛏（Niu et al.，2013）、皱纹盘鲍（Qiu et al.，2013）和皱褶冠蚌（Yi et al.，2018）的肝胰腺、闭壳肌、外套膜和鳃组织中均有表达，且在肝胰腺中高表达;在刺参的体腔、触手、肠道、呼吸树和肌肉中也有表达，以肠道中的表达量最高（Chen et al.，2017）。本研究也发现，CatB基因在大珠母贝外套膜的套膜区、边缘膜区和中央膜区及肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等7个组织中均有表达，以在肝胰腺中的相对表达量最高，显著高于在其他组织中的相对表达量，其次是外套膜的套膜区和中央膜区，与在文蛤（Yao et al.，2011）、缢蛏（Niu et al.，2013）、皱纹盘鲍（Qiu et al.，2013）和皱褶冠蚌（Yi et al.，2018）中的研究结果一致。肝胰腺是贝类消化代谢最旺盛的器官（王志新等，2013），CatB基因在大珠母贝的肝胰腺中高表达，故推测CatB参与大珠母贝的消化代谢过程。

CatB不仅在动物卵巢卵母细胞的发生和胚胎及幼虫发育过程中发挥重要作用，还具有蛋白消化功能（黄媛等，2016）。Yang等（2006）研究发现CatB可分解脂肪体，并参与昆虫的变态过程;Tingaud-Sequeira等（2011）研究表明，CatB可水解卵黄蛋白为胚胎发育提供必需的原料;Wang等（2011）通过文蛤饥饿进食推测CatB参与其营养消化代谢过程;Yao等（2011）研究认为，CatB可能通过调节消化吸收而参与文蛤的生长发育。综合上述研究结果，进一步暗示CatB可能参与大珠母贝的消化吸收过程，但CatB对大珠母贝的具体作用机理尚未明确，有待深入探究CatB在大珠母贝生长代谢中的调控作用。

4 结论

CatB基因在大珠母贝肝胰腺中高表达，其次是外套膜的套膜區和中央膜区，故推测CatB是通过参与大珠母贝的消化吸收作用而调控其生长代谢过程。

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（責任编辑 兰宗宝）