基于PI3K/Akt信号轴探究三石生新膏对大鼠压疮面愈合的影响

高 翔，洪利凯，沈 薇 ，龚竹韵

(安徽中医药大学第二附属医院 1.普外科、2.药剂科,安徽 合肥 230061)

压疮(pressure ulcers，PU)是由于局部组织长时间受压迫导致的血流和组织营养的缺乏从而最终引起皮肤和皮下组织溃疡和坏死[1]。既往研究证实，在临床上PU是瘫痪病人的并发症之一，具有延长患者住院时间、增加病死率以及加重诊治费用等特点[2]。因此，积极探寻PU的药物治疗对于改善其临床症状具有重要意义。

三石生新膏是一种中药复方制剂，具有消肿止痛、祛腐生肌等功效。临床实验研究据表明三石生新膏能够改善混合痔术后肛缘水肿、促进创面愈合[3]。基础研究发现三石生新膏能够通过上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，促进大鼠慢性感染性创面伤口愈合[4]。既往研究证实血管新生通过出芽的方式延伸出分支血管，并最终形成血管网络。而创面修复愈合是一系列复杂的过程，其中新生肉芽组织的形成是影响创面愈合的重要因素。研究证实丰富的新生毛细血管是充实肉芽组织的关键步骤[5]。因此，通过调控创面伤口血管新生对于改善PU尤为关键。但是有关三石生新膏对PU伤口修复的影响及其作用机制尚不清楚。磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase，Akt)信号通路与血管新生密切相关。研究表明激活PI3K/Akt信号能够上调VEGF，促进慢性感染性创口愈合[6]。因此，本研究拟通过局部组织缺血/再灌注损伤构建大鼠PU模型，探究三石生新膏对能否通过调控PI3K/Akt信号轴促进血管新生，从而为PU的三石生新膏临床治疗提供新的视角。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 雄性，SPF级，体质量(200±20)g，8周龄的SD大鼠50只，动物由安徽医科大学实验动物学部提供同，合格证号：SCXK(皖)2017-001，该实验通过了动物实验医学伦理委员会批准。

1.1.2试剂与药品 苏木素-伊红(hematoxylin and eosin staining，HE)染色液(碧云天生物技术公司，批号：C0105S)；VEGF检测试剂盒(康朗生物公司，批号：KLC108.96)；VEGF兔单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology，批号：5583)；p-PI3K小鼠单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology，批号：14220)；p-Akt小鼠单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology，批号：15071)；β-actin小鼠单克隆抗体(江苏碧云天生物技术公司，批号：5174)；一抗、二抗稀释液(江苏碧云天生物技术公司，批号：P0023A-100 mL)；山羊抗小鼠(江苏碧云天生物技术公司，批号：A0286)；山羊抗兔(江苏碧云天生物技术公司，批号：A0277)；兔SP免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司，批号：Sp-9001)；极超敏ECL发光试剂盒(江苏碧云天生物技术公司，批号：P0018FS)。三石生新膏：主要包括制炉甘石，煅石膏，滑石各60 g，当归、白芨、龙血竭各20 g，冰片0.6 g，马勃18 g，紫草、血珀各12 g，以上组分通过碾磨成成为极细粉末，并使用麻油500 g调至均匀后加入凡士林100 g制备成黏度适中的乳膏，即为三石生新膏。贝复新：重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶(珠海亿胜生物制药有限公司，国药准字S20040001)规格：21000IU/5g/支。PI3K抑制剂LY294002(sigma公司，批号：S1737-1 mg)

1.1.3仪器 高速冷冻离心机(美国Thermo Scientific公司)；Multiskan MK2酶标仪(印度Labsystem公司))；RM2016病理切片机(德国徕卡公司)；042BR12088电泳仪(美国Bio-Rad公司)；FCM凝胶成像系统(美国Protein Simple公司)；BX51光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1动物造模、分组与给药 实验SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、压疮模型组(Model)、贝复新阳性对照组(bFGF)、三石生新膏治疗组(TM)、压疮模型+阻断剂组(TM+LY294002)每组各10只。大鼠术前禁食12 h，吸入乙醚麻醉，并于背部正中线处性皮肤制备。备皮后，采用手术刀纵向切开至筋膜，钝性分离，并于大鼠背部皮下植入铁盘(铁盘直径16 mm，厚度2 mm)，之后缝合筋膜和皮肤表层。体外采用金属磁盘与大鼠体内的铁盘产生吸压进而造成局部性皮肤缺血。缺血2 h后，移动体外磁盘恢复血液灌流，再灌注时间0.5 h。以上缺血2 h再灌注0.5 h为一个周期，之后按照每天5个周期，连续操作3 d，最后取下大鼠体内铁盘。Sham组大鼠仅仅采取大鼠背部正中线纵向切口以及皮肤缝合。在大鼠造模成功后，Model组大鼠对创面进行换药1次，连续14 d。换药处理方法：创面碘伏常规处理，外敷单层凡士林纱布，然后再创面上加盖两层消毒干纱布，胶布固定。bFGF组大鼠：对创面进行换药1次，连续14 d。换药处理方法：创面碘伏常规处理，外加贝复新(重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶)软膏涂抹，而后采用凡士林纱布贴于创面处，最后在创面上加盖两层消毒甘纱布。TM组大鼠：对创面进行换药1次，连续14 d。换药处理方法创面碘伏常规处理，三石生新膏涂抹创面，厚度约1 mm，而后采用凡士林纱布贴于创面处，最后在创面上加盖两层消毒干纱布。TM+LY294002组大鼠：每天给予阻断剂LY294002溶液腹腔注射，注射剂量为0.3 mg·kg-1·d-1，同时每天对创面进行换药1次，连续14 d。换药处理方法创面碘伏常规处理，三石生新膏涂抹创面，厚度约1 mm，而后采用凡士林纱布贴于创面处，最后在创面上加盖两层消毒干纱布。

1.2.2各组大鼠创面愈合率比较 在各组大鼠创伤建立1 d后，利用透明纸测量各时间点(3 d、7 d、14 d)的创面面积。其中本实验以大鼠PU模型建立1 d后，测量的面积为创伤面积。利用ImageJ对各时期各组大鼠创伤面积进行计算。愈合面积=创伤面积-各时间点创伤面积。创伤面积愈合率/%=(创伤愈合面积/创伤面积)×100%。

1.2.3病理取材 观察各组大鼠创面愈合情况，并于创伤后3 d每组随机性选取6中大鼠进行麻醉。心脏采血后分离血浆并放置于-20 ℃冰箱保存待测。待采血完成后剪去部分创伤面皮肤组织，一部分使用4%的多聚甲醛固定行HE染色和免疫组化，另外一部分放置-80 ℃冰箱保存后续进行Western blot实验。

1.2.4HE染色观察各组大鼠创面病理损伤情况 取出已经固定好的各组大鼠创面皮肤组织，脱水、透明、包埋、石蜡切片，切片厚度约4 μm，并按照HE染色试剂盒进行创面皮肤染色，显微镜下观察各组大鼠创面皮肤组织形态学变化。

1.2.5酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定各组大鼠血浆VEGF含量 各组大鼠乙醚麻醉后，心脏采血，4 ℃，3 000 r·min-1，离心10 min，吸取上清液血浆，按照VEGF检测试剂盒进行含量测定。

1.2.6免疫组化检测各组大鼠创伤皮肤组织VEGF表达 将大鼠创伤皮肤组织的石蜡切片置于60 ℃烤箱内脱蜡，然后二甲苯浸洗，梯度乙醇溶液脱水。将皮肤组织切片置于10 nmol·L-1的柠檬酸盐缓冲溶液中，90 ℃抗原修复30 min。室温条件下，自然冷却并用去离子水缓慢冲洗。采用3%的H2O2溶液孵育10 min后，加入10%的BSA溶液封闭20 min。加入VEGF兔单克隆抗体(工作液体积稀释比例为1 ∶200)，4 ℃条件下孵育过夜。加入山羊抗兔二抗，室温条件下孵育30 min。滴加DAB显色液，显色后拍照，观察皮肤组织中VEGF表达水平。

1.2.7Western blot检测创面组织相关蛋白表达 取各组大鼠创面皮肤组织，组织碾磨，裂解；BCA法测定蛋白质浓度；凝胶电泳；湿转转膜；上样；用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，孵育对应VEGF兔单克隆抗体(1 ∶1 000)，p-PI3K小鼠单克隆抗体(1 ∶1 000)，p-Akt小鼠单克隆抗体(1 ∶1 000)以及β-actin小鼠单克隆抗体(1 ∶2 000)，4 ℃过夜，孵育对应的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)1-2 h，；摇床摇晃上加TPBS洗涤3次，5 min/次，然后加入显影液，显影并拍照。VEGF、p-PI3K和p-Akt蛋白表达以目的蛋白条带灰度值与β-actin灰度值相比反映。

2 结果

2.1 三石生新膏对大鼠创面愈合率的影响干预3 d后，各组大鼠创面部分开始出现结痂，组织渗透液减少，bFGF和TM组大鼠开始出现肉芽组织(见Fig 1)。干预7 d后，Sham组大鼠结痂皮肤脱落，创面皮肤颜色趋于正常，而Model组、bFGF组、TM组以及LY294002组大鼠皮肤创面面积明显缩小，有丰富的肉芽组织，且创面外缘有大量新生皮肤。干预14 d后，bFGF组和TM组大鼠皮肤已经接近正常，仅有小部分的深层结痂Model组和LY294002组大鼠有小部分创面未有愈合。干预3 d、7 d、14 d，与Model组大鼠相比，TM组大鼠皮肤愈合率明显升高(P<0.01)；与TM组相比，TM+LY294002抑制剂组大鼠皮肤愈合率降低(P<0.05或P<0.01)(Tab 1)。

2.2 三石生新膏对大鼠皮肤组织病理学特征的影响HE染色显示Sham组大鼠皮肤形态完整，复层鳞状上皮细胞结构排列规整，细胞间隙无炎症细胞浸润。Model组大鼠皮肤细胞排列紊乱，复层鳞状上皮细胞结构模糊且部分出现断裂，并伴有大量的炎症细胞浸润。bFGF组和TM组大鼠细胞间隙有少量的炎症细胞浸润且存在较多新生肉芽组织，以及丰富的毛细血管网络与成纤维细胞。TM+LY294002组大鼠皮肤形态不完整，上皮细胞结构模糊且排列不规则，存在大量的炎症细胞浸润现象，但是皮肤组织有少量可见的新生肉芽组织以及血管(Fig 2)。

Tab 1 Effect of Sanshi Shengxin Ointment on wound healing rate in n=6)

2.3 三石生新膏对大鼠血浆VEGF含量的影响干预3 d后，ELISA检测各组大鼠血浆VEGF含量。结果显示与Sham组相比，Model组大鼠血浆VEGF水平明显降低(P<0.01)。与Model组相比，bFGF组和TM组大鼠血浆VEGF水平明显升高(P<0.01)。与TM组相比，TM+LY294002组大鼠血浆VEGF水平明显降低(P<0.05)(Fig 3)。

2.4 三石生新膏对大鼠创面皮肤组织VEGF表达的影响干预3 d后，免疫组化和Western blot检测各组大鼠创伤面组织VEGF表达。结果显示与Sham组相比，Model组大鼠皮肤组织VEGF表达明显降低(P<0.01)。与Model组相比，bFGF组和TM组大鼠皮肤组织VEGF表达明显升高(P<0.05或P<0.01)。与TM组相比，TM+LY294002组大鼠皮肤组织VEGF表达明显降低(P<0.01)(Fig 4)。

Fig 1 Effect of Sanshi Shengxin Ointment intervention for 3 days on healing of pressure wounds

Fig 2 Effect of Sanshi Shengxin Ointment on histopathological characteristics of rat skin(400×)

Fig 3 Effect of Sanshi Shengxin Ointment on contentof plasma VEGF in

2.5 三石生新膏对大鼠皮肤组织p-PI3K、p-Akt表达的影响干预3 d后，Western blot检测各组大鼠创伤皮肤组织PI3K/Akt表达。结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠皮肤组织p-PI3K、p-Akt表达均明显降低(P<0.01)。与Model组相比，bFGF组和TM组大鼠皮肤组织p-PI3K、p-Akt和VEGF表达均明显升高(P<0.01)。与TM组相比，TM+LY294002组大鼠皮肤组织p-PI3K、p-Akt表达均明显降低(P<0.05或P<0.01)(Fig 5)。

3 讨论

创面愈合率是判断药物干预PU治疗效果的关键指标之一。既往研究已经证实止血、炎症过度反应、细胞增殖与修复时期以及伤口重塑是PU创面愈合的病理生理过程[7-8]。VEGF是唯一作用于血管内皮细胞的生长因子，具有促进血管新生的作用[9]。研究表明在创面止血时期，血小板被激活后或促进VEGF释放，有利于炎症时期创面血管通透性增加，进而促进炎症细胞富集于创面并最终清除创伤表面坏死物质。增殖修复时期，真皮细胞和表皮细胞开始修复，促进角质向细胞转化释放VEGF，促进血管内皮细胞增殖、迁移分化为具有功能性的血管网络[10]。在创面重塑时期，VEGF能够促进瘢痕组织的形成，加快创伤面愈合[11]。以上研究表明VEGF在PU的创面愈合中发挥关键作用。因此，通过探寻有效药物调节VEGF表达对于治疗PU至关重要。

Fig 4 Effect of Sanshi Shengxin Ointment on expressionof VEGF in rat wound skin

Fig 5 Effect of Sanshi Shengxin Ointment on expressionof p-PI3K and p-Akt in rat skin

三石生新膏源自《疡科心得集》具有消肿止痛、祛腐生肌等功效。因此，本研究首先通过构建PU大鼠模型，探究三石生新膏对创面愈合的影响。结果显示与Model组大鼠相比，三石生新膏能够提高大鼠创面的愈合率，促进血管形成，加快新生皮肤产生。以往研究显示，三石生新膏的有效成分炉甘石、煅炉甘石均能够有效改善血液循环，加快创伤口新陈代谢，促进创面成纤维细胞增殖以及毛细血管网形成，并最终达到促进皮肤创面愈合[12]。HE染色显示Sham组大鼠皮肤形态完整，复层鳞状上皮细胞结构排列规整，细胞间隙无炎症细胞浸润。Model组大鼠皮肤细胞排列紊乱，复层鳞状上皮细胞结构模糊且部分出现断裂并伴有大量的炎症细胞浸润。bFGF组和TM+LY294002组大鼠细胞间隙有少量的炎症细胞浸润且存在较多新生肉芽组织以及丰富的毛细血管网络以及成纤维细胞。以上研究结果初步表明三石生新膏能够改善PU大鼠创面损伤。基于VEGF对PU创面愈合的关键性。本实验进一步检测了三石生新膏对PU大鼠血浆VEGF水平以及皮肤组织VEGF表达的影响。结果显示，与Model组相比，三石生新膏能够促进VEGF表达。但是有关三石生新膏对PU大鼠VEGF的调控机制尚不清楚。以往研究PI3K/Akt作为细胞增殖关键信号通路。激活PI3K/Akt能够上调VEGF，促进创伤面愈合[13]。研究表明LY294002能够抑制PI3K/Akt信号活化，能够降低血管内皮细胞NO合成酶，继而降低NO释放，并最终降低血清VEGF含量[14]。此外，PI3K/Akt能够通过激活GSK3、mTOR等上调HIF-1α表达，继而增加VEGF表达[15]。因此，本研究通过检测创面皮肤组织PI3K/Akt信号相关蛋白表达。结果显示与Model组相比，三石生新膏组大鼠皮肤组织p-PI3K、p-Akt表达均明显升高。提示：三石生新膏可能通过PI3K/Akt信号轴作用于VEGF，进而促进PU大鼠创面愈合。LY294002作为PI3K特异性抑制剂能够有效抑制PI3K/Akt信号活化[16]。实验结果表明，抑制PI3K/Akt信号活化能够抑制VEGF表达，降低三石生新膏促进PU大鼠创面愈合。

综上所述，本研究通过局部组织缺血/再灌注损伤法制备压疮大鼠模型，探究三石生新膏对PU大鼠创面愈合的影响及其作用机制。结果发现，三石生新膏能够促进PU大鼠创面愈合，其机制与激活PI3K/Akt信号，促进VEGF表达相关。但是本实验亦存在一定的不足，即未能阐明三石生新膏中何种中药成分或是单体对PU创面愈合的影响。因此，在后续实验研究中将通过分离三石生新膏的有效单体成分，体外探究其对PU血管新生的影响及其调控机制。通过以上研究将进一步明确三石生新膏的药理学作用，继而为PU的临床治疗提供可靠的实验依据。