基于血清代谢组学的偏头痛性别差异研究

贾元威，王 萍，谢海棠，沈 杰，胡容峰

(1.皖南医学院弋矶山医院药物临床评价中心，安徽 芜湖 241001； 2.安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230012)

偏头痛流行病学统计显示，偏头痛的流行病学、临床特征和病理生理学存在显著性别差异，男女比例约为1 ∶2-1 ∶3，对女性群体的危害更大[1-5]。血清代谢组学灵敏度高，检测样本易于获取，常作为疾病早期小分子代谢物变化的重要检测手段[6]。本研究构建硝酸甘油型实验性偏头痛大鼠模型，基于SCIEX TripleTOF® 5600 LC-Q/TOF-MS分析技术，采用血清代谢组学，探索偏头痛性别差异机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级Sprague Dawley大鼠，体质量(180-220) g，购买自济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(鲁)20190003。

1.1.2 试剂与仪器 硝酸甘油注射液(河南润弘制药股份有限公司，批准文号：国药准字 H20057216)；SCIEX TripleTOF® 5600 LC-Q/TOF-MS(Foster City, CA)。

1.2 方法

1.2.1 硝酸甘油型实验性偏头痛大鼠模型构建 空白组与模型组，20只大鼠，各包括雌雄两组。大鼠隔天连续(d 1、3、5、7、)皮下注射硝酸甘油(10 mg·kg-1, 2 mL·kg-1)。

1.2.2 样本采集 3%戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)进行麻醉，使用采血针腹主动脉采血至5 mL采血管(无抗凝剂)，4 ℃静置过夜，8 000 r·min-1离心15 min，取血清分装于干净的EP管中，-80 ℃保存待测。

1.2.3 样本预处理 血清50 μL加入200 μL含有内标 13C-谷氨酰胺的甲醇溶液(10 mg·L-1)，涡旋震荡5 min，4 ℃，18 000 r·min-1、离心10 min。取上清200 μL于EP管中, 减压挥干溶剂(3.5 h，不加热，真空度10，Temp 4 ℃)，超纯水100 μL复溶，4 ℃，18 000 r·min-1，离心10 min，取上清20 μL进样。

1.2.4 LC-Q/TOF-MS分析条件 色谱柱：Amide XBridge HPLC (3.5 μm; 4.6 mm×100 mm; Waters, USA)，流动相为5 mmol·L-1醋酸铵(pH 9)和5%乙腈，柱温40 ℃，流速0.4 L·L-1，梯度洗脱。MS检测采用正离子和负离子两种模式进行，ESI源参数：Gas 1，33psi；Gas 2，33psi；CUR，25 psi；离子喷雾电压-4 500/4 500 V；TEM，500 ℃；CE：-10/10 V。

1.2.5 统计学处理 采用 Analyst TF 1.6.1(AB SCIEX，MA，USA)进行质谱数据采集，使用 AB SCIEX 的PeakView 和 MultiQuant 2.0进行数据探索和峰面积积分。校正后的数据导入SIMCA-P 13.0(Umetrics，Sweden)软件中进行PLS-DA多元变量统计分析；Metabo Analyst 4.0 (http://www.metaboanalyst.ca)检索平台进行代谢通路分析。

2 结果

2.1 模型构建与验证与空白组相比，雌雄大鼠模型组行为学变化(0-120 min挠头次数)明显升高、血清中降钙素基因相关肽(CGRP)含量明显升高、血清中五羟色胺(5-HT)含量模型组表明明显降低，差异均具有统计学意义(P<0.01)。模型建立成功。

2.2 多元统计分析雄性大鼠和雌性大鼠血清样本 PLS-DA 模型R2Y、Q2分别为 0.839、0.62与0.944、0.651，表明空白组雄性大鼠和雌性大鼠血清样本与模型组雄性大鼠和雌性大鼠血清样本能完全分离开，显示两组大鼠血清具有明显的代谢水平差异。

Tab 1 Serum metabolism biomarkers in migraine model and healthy control group

2.3 大鼠偏头痛差异代谢物筛选与鉴定通过SPSS 18.0软件对空白组大鼠和模型组大鼠进行独立样本t检验，以P<0.05为标准初步筛选出差异代谢物，通过Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库对差异代谢物进行鉴定。最终筛选出与偏头痛有关的差异代谢物雄性大鼠23个，雌性大鼠9个(Tab 1)。

3 讨论

应用Metabo Analyst 4.0在线工具对雌雄大鼠体内差异代谢物进行富集拓扑分析，雄性大鼠主要涉及代谢通路为：氨酰基-tRNA生物合成、嘧啶代谢、精氨酸生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、磷酸戊糖途径、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、酮体的合成与降解。雌性大鼠主要涉及代谢通路：氨酰基-tRNA生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。本研究为偏头痛性别差异血清代谢组学的首次报道。