基于网络药理学探讨大补脾汤治疗肝癌的作用机制＊

骆亚莉，安方玉，颜春鲁，冯彩琴，刘永琦，李研，王碧雯

（1.甘肃中医药大学甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室兰州730000；2.甘肃中医药大学敦煌医学与转化教育部重点实验室兰州730000；3.甘肃中医药大学第二附属医院兰州730000）

在我国与癌症相关死亡的常见原因中，肝癌在男性排列第2位（15.2%），在女性排列第五位（8.9%）[1,2]，目前临床疗效有限，且进展迅速，因此亟待开发有效治疗肝癌的药物。中医药以其多靶点起效、毒副反应小在治疗恶性肿瘤方面已经显现出独特优势。

大补脾汤源自敦煌卷子《辅行诀脏腑用药法要》，在敦煌出土医方著作中较为完整，为治疗脾气虚弱兼阴液亦损证所设。记载主要成分为人参、甘草、干姜、白术、麦门冬、五味子、旋覆花[3]。人参、麦门冬、五味子益气养阴敛汗，旋覆花降逆止呕，白术、甘草合用补气健脾调中，干姜鼓动脾胃阳气以助运化。大补脾汤已运用于脾胃疾病的临床治疗并显示出良好的效果[4-5]，但目前未见治疗肝癌的报道。中医认为，脾虚是肝癌发生发展的重要因素[6]，通过调养脾胃而长养肝木之脏，扶正助肝脾生养发陈以祛除毒邪，达到治疗肝癌的功效[7-9]。长期以来，运用中药干预治疗肝癌的实验研究工作不少，但是以“一个基因、一个药物、一个疾病”为主导范式的传统药物研发模式存在明显不足。作者前期预实验发现大补脾汤对于治疗荷瘤小鼠肝癌具有一定疗效，但作用机制还有待探索。网络药理学基于“疾病-基因-靶标-药物”相互作用网络，系统观察药物对疾病网络的干预与影响，可有效预测药物的功效或特定功效对应的药物[10-11]。本研究首次利用网络药理学方法对大补脾汤治疗肝癌的可能靶点进行预测分析，为进一步开展大补脾汤的作用机理及抗癌候选药物的研发提供思路。

1 研究方法

1.1 大补脾汤化学成分的整理和筛选

《辅行诀脏腑用药法要》记载大补脾汤的主要成分为人参、甘草、干姜、白术、麦门冬、五味子、旋覆花[3]。通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）数据库和中国台湾中医药资料库（http://tcm.cmu.edu.tw/zh-tw/）对大补脾汤的化学成分进行搜集与整理。

1.2 大补脾汤主要成分的靶点预测

1.2.1 Lipinski规则、类药性、口服生物利用度筛选

Lipinski规则（Lipinski rule，LR）是药物分子设计和药物筛选的常用规则之一，可以比较准确地预测药物中化合物的吸收或渗透性能，有助于筛选出有效药物成分，降低药物开发成本[12]。LR规则包括：①分子量不超过500 Da（MWT≤500）；②氢键供体的成分不超过5个（H-bond donors≤5）；③氢键受体不超过10个（H-bond acceptors≤10）；④脂水分配系数不超过5（CLogP≤5）。违背了这些规则中的2条以上，便有90%以上的把握预测这些化合物的口服吸收差，根据LR规则对数据库分析出的大补脾汤化学成分进行筛选。根据TCMSP数据库的建议及综合文献考虑[13]，选择类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%为筛选条件。

1.2.2 治疗靶点预测

应用瑞士靶点预测数据库Swiss Target Prediction（http://www.Swisstarget prediction.ch/），根据化合物2D and 3D相似性方法查找1.2.1筛选所得的大补脾汤活性成分的相关靶点[14]，Organism选择Homo Sapiens，整理以上各化合物对应的靶点，入选预测概率≥0.5的分子作为可能的靶点。同时，应用治疗靶标数据库（Therapeutic Target Database，TTD）（https://db.idrblab.org/ttd/），将1.2.1筛选所得的大补脾汤活性成分分别录入“Search for Drugs”中进行检索，查找以上化合物对应的靶点。将Swiss Target Prediction和TTD预测的靶点结果进行合并，去除重复，建立大补脾汤治疗作用靶点数据库。

1.3 大补脾汤治疗肝癌靶点的搜集

应用Liverome数据库（http://liverome.kobic.re.kr/）和肝癌数据库OncoDB.HCC（http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/）搜索目前已经研究报道的肝癌的治疗靶点。收集标准为OncoDB.HCC数据库实验验证的基因。建立肝癌靶点数据库。利用韦恩图分析软件VENNY2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）将预测的大补脾汤治疗作用靶点与肝癌靶点进行合并，取其交集，建立大补脾汤治疗肝癌的预测靶点库。

1.4 大补脾汤治疗肝癌预测靶点的生物过程与通路的富集分析

应用David数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对输入基因进行生物过程和通路的富集分析。对上述交集基因进行GO分析，分别从生物过程、细胞组分、分子功能三个方面进行分析。对作用靶点进行GO注释分析及KEGG通路分析。并按照每个条目涉及的靶点数目进行排序，筛选排名靠前的生物过程和通路，采用GraphPad Prism分析软件（Version 7.0）软件对结果进行可视化[15]。

1.5 大补脾汤治疗肝癌作用靶点蛋白的功能归属分析

为进一步探索上述大补脾汤治疗肝癌作用靶点（交集基因）之间的相互关系，利用String数据库（https://string-db.org/，Version 11.0）和Cytoscape分 析 软 件（Version 3.6.1）建立上述交集基因的蛋白相互作用网络。将大补脾汤治疗肝癌的预测靶点导入String数据库，应用Multiple proteins工具，限定物种为“人”，建立蛋白互作关系并以TSV格式保存文件。将文件信息导入Cytoscape软件，形成蛋白互作网络。

1.6 “活性成分-靶点-通路”网络构建与分析

归纳整理大补脾汤的活性成分与其对应的作用靶点，建立药物成分与作用靶点的对应关系。将大补脾汤的活性成分、治疗肝癌靶点和代谢通路数据导入Cytoscape3.6.1软件。采用Merge工具构建大补脾汤“成分-靶点-通路”网络模型。根据各成分对应通路及相应degree值筛选大补脾汤治疗肝癌的主要药效成分及作用靶点和重要通路。

2 研究结果

2.1 大补脾汤活性成分的筛选

大补脾汤共有810个化合物。其中，甘草含化合物数量最多，麦冬含化合物数最少。分析810个化合物，满足LR规则的化合物在甘草中数量最多，麦冬中数量最少；满足OB≥30%和DL≥0.18规则的化合物在甘草中数量最多，干姜中数量最少。

同时满足LR、OB和DL全部规则的化合物，即大补脾汤潜在的活性成分共有118个。其中，甘草中数量最多达82个，占甘草全部化合物的30%；其次为旋覆花（12个，27%）和人参（10个，5%），而五味子（6个）、白术（5个）、干姜（2个）和麦冬（1个）均较少，结果见表1。

表1 大补脾汤活性成分分布及预测结果

2.2 大补脾汤活性化合物的靶点预测

按照上述筛选所得大补脾汤118个活性成分，利用Swiss数据库进一步预测其作用靶点，结果显示，共找到68个成分，对应5505个作用靶点，预测概率≥0.5的靶点共112个。同时，利用TTD数据库预测结果显示，干姜、白术、麦冬和五味子中无对应的成分及作用靶点。人参有1个成分，对应9个作用靶点；甘草有7个成分，对应13个作用靶点；旋覆花有3个成分，对应4个作用靶点。去除重复，共找到11个成分，作用靶点为16个。

合并Swiss数据库与TTD数据库预测结果，去除重复的8个靶点，得到大补脾汤作用靶点共120个。

2.3 肝癌基因靶点库建立

利用Onco数据库搜集肝癌基因靶点为394个，利用Liver数据库搜集肝癌基因靶点为241个。合并两数据库搜集结果，去除重复的58个靶点，得到肝癌基因靶点共576个。

2.4 大补脾汤治疗肝癌潜在靶点筛选

将上述预测的大补脾汤作用靶点120个与肝癌基因靶点576个进行合并，取交集后，得到大补脾汤治疗肝癌的可能靶点共29个。包括：ABCB1、ABCG2、AKR1B10、AKR1C2、AKR1C3、ALDH2、AR、ARG1、CA1、CA2、CA3、EGFR、ESR1、IL2、MCL1、MET、MMP12、MMP2、MMP3、MMP9、NEK6、PARP1、PLK1、PTGS2、PTK2、SRC、TERT、TOP2A和TTR（图1、表2）。

图1 大补脾汤治疗肝癌的潜在靶点

2.5 靶点基因功能注释

运用David软件中Functional Annotation Tool工具，对29个靶点基因进行功能注释（表2）。

表2 大补脾汤治疗肝癌的潜在靶点

2.6 靶点基因GO富集分析和KEGG通路富集分析结果

运用David软件对29个靶点基因进行GO富集分析，分别从生物过程、细胞组分、分子功能三个方面进行分析。其中，生物过程中排名靠前的有内在凋亡信号通路的负调控、一氧化碳代谢过程、表皮生长因子受体信号通路、肽-酪氨酸自动磷酸化、整合素介导的信号通路等（图2a）。在细胞组成分析中靠前的主要是细胞外基质、细胞膜的胞质侧外部成分（图2b）。分子功能分析靠前的主要是碳酸氢酶活性、锌离子结合、金属异位酶活性、ATP结合、非膜生成蛋白酪氨酸激酶活性等（图2c）。

图2 靶点基因GO富集分析

KEGG通路分析比较靠前的是：癌症中的微小RNA、雌激素信号通路、膀胱癌、癌症中的蛋白聚糖、氮代谢、癌症相关通路、胆汁分泌、黏附连接、GNRH信号通路、TNF信号通路等（图3）。

图3 靶点基因KEGG通路富集分析

2.7 大补脾汤治疗肝癌潜在靶点对应的药物成分

将上述大补脾汤治疗肝癌靶点与对应的药物成分进行归纳，表3结果显示共计65个化合物，其中属于甘草的化合物最多（30个）、属于人参的化合物次之（21个）和旋覆花最少（14个）。甘草的化合物对应的作用靶点最多（24个），人参次之（21个），而旋覆花最少（11个），共计56个，去除重复即大补脾汤治疗肝癌的可能靶点共29个。具体的药物成分与对应靶点见表4。其中，作用于靶点ABCB1、ABCG2和CA2的中药成分最多；而人参中的山奈酚（kaempferol）、甘草中的槲皮素（quercetin）和旋覆花中的木犀草素（luteolin）可针对多靶点发挥治疗作用。

表3 大补脾汤治疗肝癌的药物成分及对应靶点数量

表4 大补脾汤药物成分-治疗肝癌潜在靶点对应关系

2.8 大补脾汤治疗肝癌潜在靶点的蛋白相互作用

在此相互作用网络中，共有节点29个，102条边。平均节点度数为7.03，平均局部聚类系数0.654，PPI富集P值<1.0e-16（图4）。

图4 靶点基因相互作用网络（string）

对29个基因的相互作用进行分析，基因TTR、CA3、AKR1B10以及ALDH2与其它基因的相互作用较弱。在其余25个互作基因当中，利用Cytoscape软件中的cytoHubba插件按照degree将前十名关键基因进行筛选分别是：EGFR、SRC、PTGS2、MMP9、MMP2、MCL1、MET、AR、ESR1和IL2（图5）。

图5 靶点基因相互作用（Cytoscape）

2.9 成分-靶点-通路对应关系分析

用红色圆点代表靶点，蓝色菱形表示成分，对成分-靶点对应关系进行分析（图6）。利用Cytoscape软件中的cytoHubba插件进行筛选，按照degree分别将关键成分和靶点基因排序。按照度数排名前五位的成分分别是：山奈酚kaempferol、槲皮素quercetin、木犀草素luteolin、异刺芒柄花素HMO、乔松素Pinocembrin。按照度数排名前五位的靶点基因分别是：CA2、ESR1、ABCB1、ABCG2和ARG1。

图6 成分-靶点对应关系

为全面客观地揭示大补脾汤抗肝癌的可能有效成分及潜在的作用靶点及其通路，运用上述数据构建“药物-靶点-通路”交互网络并进行可视化分析，呈现大补脾汤抗肝癌的复杂网络关系，并对各靶点的相关参数进一步分析（图7）。蓝色菱形代表成分，绿色椭圆形表示通路，红色圆点代表靶点。经分析，筛选抗肝癌的主要活性成分为山奈酚、槲皮素、木犀草素等，主要靶点为EGFR、ESR1、SRC、MET等。涉及的主要通路包括微小RNA、雌激素信号通路、癌症中的蛋白聚糖、癌症相关通路等。

图7 药物成分-靶点-通路对应关系图

3 讨论

中医认为，肝癌的产生是由于正气虚损，痰瘀毒结而形成。而脾是气血生化之源，是后天之本，故脾虚是肝癌发生发展的重要因素[6]，益脾养肝法可以通过调养脾胃而长养肝木之脏，调动肝木生发的机能，扶正助肝脾生养发陈以祛除毒邪，达到治疗肝癌的功效。经考证，大补脾汤为《伤寒论》之理中丸加减而成，遵循《素问·藏气法时论》“脾欲缓，急食甘以缓之，用苦泻之，甘补之”[3,16]。王道坤等[4-5]运用大补脾汤治疗脾胃疾病取得了较满意的疗效。然而目前关于大补脾汤治疗脾胃疾病的相关研究较少且以传统研究方法为主，对其具体作用机制研究较少。本组以前期动物实验研究为基础，利用网络药理学研究方法手段的优势，期望弥补传统药物研发模式的不足，对大补脾汤治疗肝癌的可能机制进行探索分析。

本研究结果显示，大补脾汤7种中药中甘草的化合物数量最多，甘草所含的有效成分数量最多，在同时满足LR、OB和DL全部规则的化合物中，甘草多达82个，其次为旋覆花和人参。提示大补脾汤发挥药效的活性成分可能主要来源于甘草、旋覆花和人参。

研究结果显示，筛选所得人参、甘草、旋覆花含有65个成分可能具有治疗肝癌的作用。近年已开展上述三种中药抗肿瘤的相关研究，人参皂苷可有效地抑制肝癌细胞的增殖和转移[17]，复方甘草酸成分具有保护肝细胞膜，减轻肝损伤的作用[18-19]，旋覆花中的倍萜类和甾体类化合物大多数显示出显著的抗肿瘤作用[20]。研究结果提示山奈酚、槲皮素及木犀草素等可能是大补脾汤治疗肝癌的主要成分。

本研究结果显示，表皮生长因子受体EGFR可能是肝癌的治疗靶点之一，与目前的研究报道一致[21]。EGFR过度表达或突变与肝癌的形成、侵袭性生长等有密切关联，并且低分化肝癌的预后与其过量表达有关[22]，因此是良好的肝癌检测指标和治疗靶点[23]。报道显示山奈酚可能通过调控EGFR的表达作用对肺癌等发挥治疗作用[24]，但对肝癌的治疗还未见报道，本研究结果提示EGFR可能是山奈酚治疗肝癌的靶点之一。本研究结果提示，槲皮素治疗肝癌的作用靶点包括EGFR、MMP等。研究显示，基质金属蛋白酶MMP对于肝癌的发生发展具有促进的作用[25]。Baby B等[26]研究发现，槲皮素与酪氨酸激酶的ATP结合位点具有良好的结合能力和相互作用，可通过EGFR/VEGFR-2途径抑制乳腺癌上皮间质转化、血管生成和侵袭性[27]，也可抑制MMP介导EGFR过度表达的头颈部鳞状细胞癌转移[28]。是否在肝癌的发生发展中EGFR与MMP之间存在通路上、下游分子的关联，以及槲皮素可否通过对二者可实现同时或同步调控还有待于进一步的研究证实。

本研究结果显示，SRC也可能是大补脾汤治疗肝癌的重要靶点之一，SRC与恶性肿瘤之间的关系正在引起学者们的重视[29-30]。中药成分可通过靶向整合素αVβ3和介导αVβ3/SRC/E2F1信号抑制肝癌细胞侵袭性形成，从而发挥抑制肿瘤转移的作用[31]。Chen R等[32]研究认为SRC激酶信号抑制物1（SRCIN1）具有抑制人肝癌HepG2细胞增殖和上皮间质转化的作用。山奈酚可通过SRC、SYK、IRAK1和IRAK4等分子靶点介导抗炎反应[33]，是否对肝癌具有抑制作用未见报道。报道显示，槲皮素和木犀草素可能通过抑制SRC/STAT3/S100A7的信号转导来治疗肿瘤[34]。本研究结果初步显示大补脾汤的主要成分山奈酚、槲皮素等可能以SRC为靶点抑制肝癌的发生发展，但有待实验研究证实。

本研究结果显示大补脾汤治疗肝癌的部分潜在靶点MET、ABCB等与筛选的miRNAs通路之间也存在相互关联，充分印证miRNA在肝癌的发生发展过程中发挥着错综复杂的调控机制。作为高度保守的内源性非编码小RNA，miRNAs与靶基因发生不完全性互补结合，导致靶基因降解或者抑制蛋白翻译，对基因表达进行转录后调控[35]。异常c-MET信号与多种癌症的高增殖指数、低分化程度、血管侵袭及转移等相关，miRNA也是激活c-MET的重要因素之一。通过调控c-MET的表达，miRNA可对肝癌细胞发挥抑制增殖、迁移和侵袭的作用。在肝癌中调控c-MET信号通路 的miRNAs包 括miR-181a-5p、miRNA-34家 族、miR-199a-3p、miR-148a、miR-363等[36，37]。miR-363的过表达可显著抑制HepG2细胞的活力并诱导其发生凋亡，其机制可能与miR-363能下调肝癌HepG2细胞MCL-1蛋白的表达有关[38]。MiR-223可通过下调ABCB1的表达来调节肝癌细胞的多药耐药性[39]。大多数miRNAs不仅能够靶向结合多个基因，而且能同时调控多条细胞通路来发挥对细胞生命活动过程的复杂调节作用。中药成分若通过miRNAs相关通路来发挥防治肿瘤的作用，则具有良好的开发前景。Tao SF等[40]研究结果表明，槲皮素可下调miR-146a及EGFR的表达抑制乳腺癌细胞的侵袭。本研究结果提示，槲皮素不仅可将EGFR作为靶点，同时可能通过调控MMP2、MMP9以及miRNA等途径来发挥治疗肿瘤的作用，充分体现了大补脾汤主要成分多点显效的作用优势。

除了miRNA调控通路，雌激素通路也可能参与肿瘤的发生发展，雌激素受体ESR是雌激素通路介导信号传递的关键环节[41]，本研究结果也显示ESR可能参与肝癌的发生发展过程。但也有研究显示[42]，ESR1基因SNP rs 9340772位点多态性与原发性肝癌的发生无关。对ESR发生变异的机制及其功能的深入研究将有助于更好地开展抗肿瘤新药的研发工作。

综上，本研究应用网络药理学方法通过预测分析显示，大补脾汤中山奈酚、槲皮素、木犀草素等可能通过调控微小RNAs和雌激素信号通路等机制，作用于EGFR、ESR1、SRC、MET等靶点发挥治疗肝癌的作用，为其抗癌的潜在候选药物的研发工作提供相关理论依据。

对照最近发布的网络药理学评价方法指南[42]，本研究涉及的中药研究和疾病研究数据库等均为目前公认的权威数据库，所用的研究方法及相关软件目前均被广泛应用于网络药理学分析检测，但基于研究条件所限仍存在以下不足之处。本研究仅采用目前较为公认的研究中药网络药理学的数据库TCMSP等对大补脾汤进行了理论预测分析，可能存在化学成分收集以及靶点预测完整性不足、以及成分随体内外环境而发生变化等问题，后续研究还需联合应用网络药理学其它数据库对相关数据进一步进行补充分析，以保障数据信息的全面和准确。而且，对研究结果的验证还需加强，本组下一步将通过建立动物疾病模型，对预测的靶点和通路进行深入的研究和分析。