A20在胆管结扎所致肝纤维化小鼠中的表达及作用机制研究

王晓晗 韩 丰 沈 亮 陈云清 沈月玉 高 晨 侯震涛 冀子中 范竹萍

肝纤维化是影响肝脏疾病转归和肝细胞癌(HCC)风险的关键因素，与肝脏疾病的进展相关[1]。尽管肝纤维化的病因不同，但其进展遵循的模式是类似的。肝星状细胞(HSC)在肝损伤后被激活，产生大量细胞外基质和促炎介质，在纤维生成中发挥着关键作用[2]。

目前已知A20是一种有效的抗炎蛋白。本课题组的既往研究发现，A20参与了肝纤维化的过程，但具体作用机制尚不清楚[3]。本研究主要探讨A20及炎性因子在胆管结扎(BDL)所致肝纤维化模型小鼠肝脏中的表达情况，并在细胞水平探讨A20的作用机制。

1 材料与方法

1.1 BDL所致肝纤维化小鼠模型的构建

采用6～8周龄的C57/B6雄性小鼠，BDL组小鼠(5只)用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，开腹，结扎胆管后关腹。对照组小鼠(5只)不结扎胆管，直接关腹。10 d后处死小鼠，留取肝脏备用。取肝脏组织，浸于4%多聚甲醛中固定，脱水透明，石蜡包埋，0.5 μm切片，脱蜡后行H-E染色，显微镜观察并作图像采集。

1.2 细胞培养

LX-2细胞是永生化的人HSC(购自ATCC)，置于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。使用0.1 μg/mL 脂多糖(LPS)处理LX-2细胞0、5、10、15、30、60 min，收获后冷冻保存备用，检测细胞中A20及炎性反应通路因子的蛋白表达水平变化。

1.3 蛋白质印迹法检测

使用蛋白裂解缓冲液从细胞中提取总蛋白，检测蛋白水平。将不同样品中等量的蛋白质经SDS-PAGE电泳后电转至硝酸纤维素滤膜中。在室温下用5%脱脂牛奶阻断非特异性蛋白结合120 min，将特异性单克隆抗体涂于膜上，4 ℃孵育过夜。用TBST冲洗后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶15 000)室温孵育1 h，TBST洗涤后显影成像，以GAPDH作为内参标准。

1.4 肝脏RNA提取

取小块肝组织置入1 mL TRIzol试剂中充分研磨。裂解后样品于室温下放置，加入氯仿后剧烈振荡，室温孵育后离心。取上层水相加入异丙醇，混匀后室温孵育、离心。乙醇清洗RNA后溶解于DEPC水中，RNA溶液置于-80 ℃保存备用。

1.5 实时荧光PCR法检测

使用PrimerScriptTMRT试剂盒(日本TaKaRa公司)，按照说明书进行cDNA合成，反应条件：37 ℃ 15 min，84 ℃ 5 s，4 ℃ 30 min。应用两步法PCR扩增程序，总反应体系10 μL，第1步95 ℃ 30 s；第2步95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。所有RT-PCR重复3次。RT-PCR引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列见表1。转化生长因子-β(TGF-β)、IL-6、IL-1β、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、Toll样受体4(TLR4)的mRNA相对表达量以2-△△Ct计算，以β-actin作为内参。

表1 引物序列

1.6 统计学处理

使用Graphpad Prism 5软件进行统计学分析，计量数据以均数±标准差表示，各组均数比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝纤维化模型小鼠的肝脏病理验证

本研究应用BDL术(术后10天)构建肝纤维化小鼠模型，小鼠肝脏经H-E染色，高倍镜下显示，对照组小鼠肝细胞呈多边形，大小正常，核圆、居中，细胞质丰富，小叶结构清晰，未见纤维组织增生；BDL组小鼠肝细胞片状坏死，大胆管增生，肝纤维化明显。见图1。

图1 两组小鼠肝脏病理图 H-E染色 ×400 A 对照组 B BDL组

2.2 两组小鼠肝脏中α-平滑肌肌动蛋白和A20蛋白的表达水平比较

应用蛋白质印迹法(Western blotting)检测两组小鼠的肝脏组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、A20蛋白的表达水平，结果显示BDL组小鼠的α-SMA蛋白表达水平(2.12±0.87)为对照组(1.01±0.16)的2.11倍，差异有统计学意义(P<0.05)；BDL组小鼠的A20蛋白表达水平(1.63±0.38)为对照组(0.66±0.47)的2.47倍，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01图2 两组小鼠肝脏中α-SMA及A20蛋白的表达水平比较 A α-SMA蛋白 B A20蛋白

2.3 两组小鼠肝脏中炎性因子的mRNA相对表达量比较

应用实时荧光PCR法(Real-time PCR)检测两组小鼠肝脏中炎性因子的mRNA相对表达量，结果显示BDL组小鼠肝脏内TGF-β、IL-6、IL-1β、MCP-1、TLR4的mRNA相对表达量(2.12±0.63，32.39±10.81，1.71±0.32，43.76±2.58，3.76±1.99)分别为对照组(1.09±0.22，5.89±4.64，0.69±0.31，1.16±0.22，0.84±0.48)的1.94倍、5.50倍、2.47倍、37.59倍、4.50倍，差异均有统计学意义(P=0.032 8、P=0.001 0、P=0.004 6、P<0.000 1、P=0.014 6)。见图3。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01图3 两组小鼠肝脏中炎性因子的mRNA相对表达量比较 A TGF-β mRNA B IL-6 mRNA C IL-1β mRNA D MCP-1 mRNA E TLR4 mRNA

2.4 LX-2细胞中A20及炎性反应通路因子的蛋白表达水平变化

使用0.1 μg/L的LPS处理LX-2细胞0、5、10、15、30、60 min，通过Western blotting检测发现IκBα、磷酸化IκBα蛋白的表达水平在处理15 min时到达高峰，随后开始下降；A20蛋白表达水平先下降，随后在处理30 min时逐渐上升。见图4。

图4 LX-2细胞中A20及炎性反应通路因子的蛋白表达水平变化

3 讨论

目前利用BDL术造成肝外胆道梗阻，引起梗阻部位以上的胆管扩张是构建小鼠肝纤维化模型的有效方法[4]。在胆管阻塞早期，门脉系统发生炎性细胞浸润，胆管增生和小胆管内胆汁淤积；如梗阻持续，纤维组织向胆管延伸，包绕肝小叶，则形成肝纤维化。本研究中，BDL组小鼠的病理图像显示肝细胞片状坏死，大胆管增生，肝纤维化明显。

A20是一种有效的抗炎分子，与人类和小鼠的多种炎性反应病理有关[5]。既往的动物模型实验结果显示，肝脏中过表达A20是急性暴发性病毒性肝炎、高危性肝切除术和严重的肝脏缺血再灌注损伤的保护因素[6]。Ramsey等[7]的研究建立了小鼠缺血再灌注损伤模型，在小鼠尾静脉注入高表达A20 的腺病毒，发现A20过表达组的存活率为67%，而对照组仅为10%～25%，并且A20过表达组的总胆红素(TBil)、ALT水平下降，肝脏出血坏死、脂肪变性减轻，肝功能改善。Man 等[8]分别利用正常大鼠和肝硬化大鼠制备肝脏缺血模型，发现A20表达上调后，两组的肝脏缺血再灌注损伤均得到改善。另有研究在蛋白质组学方面探讨原代肝细胞对缺血再灌注的反应，发现损伤后的肝细胞内A20表达明显升高[9]。有研究用LPS 刺激急性肝炎模型小鼠，结果显示A20转染组小鼠的存活率达85%，而对照组仅为15%～20%，提示A20对肝细胞有保护作用[10]。Longo等[11]的研究发现小鼠肝脏被切除78%后24 h，对照组小鼠肝细胞内A20 mRNA 水平较切除前高13 倍，而A20转染过表达组小鼠肝细胞内A20 mRNA水平较切除前高50～60 倍；术后36 h A20转染过表达组小鼠肝细胞内的肝细胞脂肪变、肝窦充血较对照组小鼠明显减轻，出血发生率明显下降。SD大鼠、LEW大鼠肝脏移植研究发现，肝脏内A20高表达有利于提高大鼠存活率，并且存活率与A20表达水平呈正相关，A20表达下调可导致小体积肝移植损伤，而高表达A20能增强小体积肝移植后的肝再生能力并提高存活率，可抵抗排异反应[12-14]。本研究发现肝纤维化模型小鼠肝脏中A20和α-SMA蛋白表达水平均升高，炎性因子TGF-β、IL-6、IL-1β、MCP-1、TLR4的mRNA相对表达量也均升高，提示A20可能参与了肝纤维化进程中的炎性反应。

NF-κB是一个关键的转录因子，通过诱导炎性反应基因的表达，可调节炎性反应级联反应的多个步骤。研究表明，抑制NF-κB/IκBα信号通路可改善肝纤维化的严重程度[15]。NF-κB调节炎性反应信号引起肝脏内促炎因子的表达，如TGF-β、TNF-α、IL-1β和IL-6等，这些促炎因子在肝纤维化的发展中发挥着重要的作用，抑制NF-κB /IκBα通路可能是肝纤维化的一个治疗方法[16]。本研究发现，经过LPS处理的LX-2细胞中，随着IκBα及磷酸化IκBα蛋白的表达水平升高，A20蛋白的表达水平降低；当IκBα及磷酸化IκBα蛋白的表达水平达到峰值后下降时，A20蛋白的表达水平开始逐步升高。可见，A20在炎性反应通路中发挥着负向调节作用，具体机制有待进一步研究。

综上所述，A20可能参与了BDL所致肝纤维化模型小鼠的炎性反应；在人HSC中，A20在炎性反应通路中发挥着负向调节作用。今后本课题组将通过过表达或沉默A20，进一步研究其在原代HSC炎性反应通路中的作用机制。