慢性乙型病毒性肝炎患者基因分型与耐药变异的相关性分析

刘 奇

（江苏省宜兴市人民医院检验科 江苏 宜兴 214200）

慢性乙型病毒性肝炎是指慢性乙肝病毒检测为阳性，病程超过半年或发病日期不明确的临床有慢性肝炎表现者[1]。患者发病早期临床多表现为乏力、畏食、恶心呕吐等，严重者可伴有慢性肝病面容、蜘蛛痣及肝功能异常等，影响患者正常生活及健康[2]。流行病学调查结果表明：我国慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者达到9 300万，且慢性乙型肝炎患者达到2 000 万例。目前，临床上对于HBV 感染治疗药物主要依赖于干扰素（interferon,IFN）、核苷酸类似物2 类，前者具有调节免疫、抗病毒及抗纤维化优点，但是药物副作用严重，使用不便且存在诸多禁忌证。而核苷类似物具有更强的抑制病毒复制的能力，能获得良好的治疗预后[3-5]。患者长期治疗过程中拉米夫定、阿德福韦等出现严重的病毒反弹及血清学突破现象。但是，临床上慢性乙型病毒性肝炎患者基因分型与耐药变异性的关系研究较少。因此，本文以慢性乙型肝炎患者为对象，探讨慢性乙型病毒性肝炎患者基因分型与耐药变异的相关性，报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年5 月—2020 年3 月我院收治的慢性乙型肝炎患者121 例，男67 例，女54 例，年龄6 ～74 岁，平均年龄（52.59±6.73）岁；病程1 ～14 年，平均（7.51±1.39）年；体重指数（BMI）18 ～27 kg/m2，平均（23.59±3.51）kg/m2；纳入标准：（1）符合2015 年《慢性乙型肝炎防治指南》中慢性乙型肝炎诊断标准；（2）均完成标本采集，且患者均可耐受[6]；（3）具有完整的基线及随访资料者。排除标准：（1）合并精神异常、认知功能异常或器质性疾病者；（2）血液系统疾病、伴有自身免疫系统疾病者；（3）严重心、肾功能异常或合并酒精性肝病、脂肪肝者。

1.2 方法

仪器与设备：全基因组提取试剂盒，购自于QIAGEN。HBV 核酸荧光检测试剂盒，购自于中山大学达安基因有限公司；荧光定量PCR 仪，型号：7500RT-PCR System 以及遗传分析仪，型号：3500DX，购自于美国ABI 公司。

方法：（1）标本采集。所有患者入院后次日取外周空腹血3 mL，35 min 离心，速度3 000 rpm，血清分离后，放置在低温下，备用；（2）检测方法。①基因型分析。采用基因测序法测定入组患者HBV 基因型，具体方法如下：取上述分离的血清标本，根据Qiagen 全基因组提取试剂盒说明书完成血浆样本HBV-DNA 基因的提取。采用普通PCR 扩增HBV P 区序列，根据检测目的设置PCR 反应参数：普通PCR 反应条件为50μL，95℃下进行3 min 预变性；94℃下30 s，57℃下30 s，72℃下40 s，连续完成35 个循环。引物均由生工生物工程股份有限公司完成；测序结果采用NCBI BLAST 及DANMAN 软件进行分析，完成HBV 基因型分析。②耐药突变位点。上述操作完毕后，完成常见核苷酸类似物（NAs）耐药突变位点测定。本研究中检测了NAs 常见的101 个耐药突变位点，包括：173L、180M、181V、184AGIS、194TM、204VIS、207MIL、213T、236T、237H 等。③HBV DNA 定量测定。取上述分离的血清标本，采用荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）仪进行定量分析，采用HBV 核酸荧光试剂盒，检测下限为100 IU/mL。每批PCR 试验均设阳性、临界阳性及阴性对照，所有操作均必须严格遵循仪器说明书完成。（3）相关性分析。采用Pearson 相关性分析软件对患者基因分型与耐药变异性进行相关性分析。

1.4 统计分析

采用SPSS 18.0 统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（x-± s）表示，行t检验；计数资料以率[n（%）]表示，行χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 慢性乙型病毒性肝炎患者检测基因分型及构成比

121 例慢性乙型病毒性肝炎患者均完成基因分型测定，结果显示：慢性乙型病毒性肝炎患者以B 型及C 型为主，分别占：59.50%和40.50%，见表1。

表1 慢性乙型病毒性肝炎患者检测基因分型及构成比

2.2 慢性乙型病毒性肝炎患者耐药位点分布及突变率

入组患者均完成耐药位点检测，结果表明：10 个常见的耐药位点中排在前3 位的分别为：204VIS、180M 及194TM，突变率分别为：52.89%、32.23%和19.83%，见表2。

表2 慢性乙型病毒性肝炎患者耐药位点分布及突变率

2.3 慢性乙型病毒性肝炎患者基因分型与耐药变异性相关性分析

Pearson 相关性分析结果表明：慢性乙型病毒性肝炎患者B 型及C 型与204VIS、180M 及194TM 呈正相关性，r 有统计学意义（P＜0.05）；与173L、181V、184AGIS、207MIL、213T、236T 及237H 无相关性，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 慢性乙型病毒性肝炎患者基因B、C 分型与耐药变异性相关性分析

3.讨论

国内学者研究表明：乙型肝炎患者HBV-DNA 载量与血清标志物水平存在紧密的联系，且乙肝病毒基因会影响该病的状况及临床治疗联系[7]。目前，我国HBV 感染患者多以B 型与C 型为主。本研究中，121 例慢性乙型病毒性肝炎患者均完成基因分型测定，结果表明：慢性乙型病毒性肝炎患者以B 型及C 型为主，分别占：59.50%和40.50%，与既往结果相符。从以往研究结果表明：C 型感染患者明显多于B 型感染患者，且C 型患者纤维化水平明显高于B 型。对于不同基因型如混合感染，不仅乙型肝病毒载量更高，亦会加重病情的发展。因此，患者治疗前确定基因型，对疾病的治疗及预后具有重要的意义。目前，临床上对于慢性乙型肝炎多以抗病毒治疗为主，多数患者经药物抗病毒治疗后症状能得到明显改善，但是部分患者治疗期间会产生变异与耐药。目前，基因型与抗病毒药物的研究更多的集中在抗病毒药物治疗上。本研究中，完成入组患者耐药位点测定，结果显示：10 个常见的耐药位点中排在前3 位的分别为：204VIS、180M 及194TM，突变率分别为：52.89%、32.23%和19.83%，从本结果看出，慢性乙型病毒性肝炎患者耐药变异率较高，导致患者预后较差。为了进一步分析慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 基因分型与耐药性的关系，本研究中对其进行Pearson 相关性分析，结果显示：慢性乙型病毒性肝炎患者B 型及C 型与204VIS、180M 及194TM 呈正相关性，r 有统计学意义（P＜0.05）；与173L、181V、184AGIS、207MIL、213T、236T 及237H无相关性，r 无统计学意义（P＞0.05），说明慢性乙型肝炎患者HBV 基因与耐药性存在紧密的联系。因此，临床上慢性乙型肝炎患者治疗前应加强患者HBV 基因型分析，了解患者基因的类型，并选择合适的抗病毒药物，尽可能降低耐药率，提高临床效果。同时，患者治疗过程中加强其生命体征监测，加强患者肝功能及HBV DNA水平测定，评估患者预后，善于根据测定结果调整治疗方法，使得患者的治疗更具科学性。

综上所述，慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 基因分型以B 型为主，其次为C 型，且不同分型患者耐药变异性存在显著差异，加强HBV 基因型及耐药性分析可指导临床用药。