ZMIZ1基因单核苷酸多态性与内蒙古蒙汉族寻常型银屑病相关性研究

黄艳平，吕新翔，孙志强，李欣，丁文媛，韩建文

（内蒙古医科大学附属医院，内蒙古自治区 呼和浩特 010010）

银屑病是一种慢性、炎症性、复发性、系统性疾病，银屑病的确切病因尚未清楚，目前认为是遗传因素和环境因素相互作用下，导致疾病发生或加重[1]。银屑病在中国的患病率约为0.47%[2]。遗传学研究已发现许多银屑病相关性易感基因，其中以HLA-C*06：02与银屑病的相关性最强。既往基于欧洲人群的研究发现ZMIZ1基因单核苷酸多态性（SNP）rs1250546与银屑病相关[3]。一项克罗恩病与银屑病的全基因组关联分析研究（GWAS）发现了7个共同易感的基因位点，其中包括ZMIZ1基因区域的3个SNP rs1250544、rs1250559、rs1250560[4]。为研究ZMIZ1基因多态性与银屑病的相关性，在内蒙古地区的蒙古族和汉族人群中，选择ZMIZ1基因区域2个SNP（rs1250546和rs1250559）及HLAC*06：02，利用二代测序及聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）进行基因分型，探讨其与内蒙古地区蒙古族及汉族人寻常型银屑病（PsV）的相关性，以及二者可能的交互作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 临床资料 收集内蒙古医科大学附属医院2012年12月—2018年3月住院的汉族PsV1 030例，蒙古族PsV379例，正常对照汉族965例，蒙古族518例。抽取外周静脉血5 mL，乙二胺四乙酸二钾（K2EDTA）抗凝，先置于-20℃预冷，然后置于-80℃冰箱保存备用。所有患者经临床及病理证实诊断，符合PsV诊断标准。所有对照排除银屑病及其他自身免疫性疾病，排除银屑病家族史。本研究已通过内蒙古医科大学附属医院伦理委员会批准，并在实施过程中遵守赫尔辛基宣言，研究对象均签署知情同意书。PsV患者中汉族：1 030例，男532例，女 498 例，平均年龄（45.49±17.11）岁；蒙古族：379例，男204例，女175例，平均年龄（42.34±15.12）岁。正常对照中汉族：965例，男542例，女423例，平均年龄（45.86±11.59）岁；蒙古族：518 例，男 275例，女 243例，平均年龄（40.78±12.48）岁。2组性别、年龄比例差异无统计学意义（P>0.05）。在病例及对照中均符合Hardy-Weinberg遗传平衡（P>0.05）。

1.1.2 多形性位点选择 根据既往文献报道，在ZMIZ1基因区域选择2个SNP[rs1250546（10：79272775）和 rs1250559（10：79293803）]及 HLA-C*06：02。

1.2 方法

1.2.1 基因组脱氧核糖核酸（DNA）提取 利用基因组DNA提取试剂盒（中国康宁生命科学有限公司）提取患者及对照组基因DNA，利用分光光度仪分别于260 nm和280 nm波长处检测吸光度，计算DNA浓度，并用凝胶电泳检测DNA质量，所有DNA样本均合格。

1.2.2 基因分型

1.2.2.1 二代测序法

①引物设计及合成：利用美国国立图书馆数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），对需要实验分型的基因相关信息进行查询。然后使用Primer3 online（version 0.4.0；http：//frodo.wi.mit.edu/，USA）软件和 Oligo[version 6.31；Molecular Biology Insights，Inc.（DBA Oligo，Inc.）USA]。软件设计2个遗传变异位点的基因分型引物、检测探针以及测序引物（引物序列合成均由上海翼和生物公司完成）。引物序列，见表1。

表1 二代测序实验中各SNP位点引物序列

②聚合酶链反应（PCR）扩增及二代测序：模板DNA经过构建待测DNA文库、多重PCR反应扩增、PCR扩增后的产物纯化、文库进行单克隆扩增及对扩增后的产物进行再纯化。纯化后的PCR产物采用二代测序方法，Miseq测序平台上机测序对选择的遗传变异进行基因分型、数据转换、判读结果。（注：测序工作均由上海翼和生物公司完成）。

1.2.2.2 PCR-SSP对HLA-C*06：02分型实验

①设计引物：根据文献报道对HLA-C*06：02基因型设计引物序列，见表2。

表2 HLA-C*06：02基因型引物序列

②PCR扩增反应、凝胶电泳分析：模板DNA经过PCR扩增反应、扩增结束后，取PCR产物6 μL，3%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像观察分析PCR产物的电泳效果，判读结果。

1.3 统计学分析 所有SNP分析数据质控、等位基因及基因型频率比较采用PLINK1.07软件（http：//pngu.mgh.harvard.edu/purcell/pink/）[5]。计算2个SNP及HLA-C*06：02的等位基因频率和基因型频率，在病例和对照中分别进行Hardy-Weinberg遗传平衡检测。采用χ2检验比较患者组及对照组等位基因频率及基因型频率，并计算等位基因的比值比（OR）及其95%可信区间（CI）。所有统计检验均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 等位基因频率比较 与对照组相比，rs1250559_C、rs1250546_T在汉族PsV患者中的频率差异无明显统计学意义（P>0.05）。而在蒙古族PsV患者中，rs1250559_C的频率（33.5%）高于对照组（27.7%），差异有统计学意义[χ2=6.43，P<0.05，OR=1.31，95%CI（1.06-1.62）]；rs1250546_T的频率（48.5%）高于对照组（43.4%），差异有统计学意义[χ2=4.71，P<0.05，OR=1.23，95%CI（1.02-1.49）]，见表3。

表3 寻常型银屑病患者与对照组ZMIZ1基因上2个SNP等位基因频率比较

2.2 分别以基因型、显性遗传模式、隐性遗传模式下进行统计分析，发现2个SNP与汉族PsV仍无相关性（P>0.05）。而在蒙古族PsV患者中rs1250559_C在隐性遗传模式下显示有相关性（χ2=6.35，P=0.012，OR=1.88），见表4；rs1250546_T在显性遗传模式下显示有相关性（χ2=5.13，P=0.024，OR=1.40），见表 5。

表4 显性及隐性遗传模式下PsV患者与对照组中rs1250559基因型分析

表5 显性及隐性遗传模式下PsV患者与对照组中rs1250546基因型分析

2.3 HLA-C*06：02 与 rs1250559_C、rs1250546_T交互作用与PsV的相关性分析

在蒙古族样本中，分别以HLA-C*06：02阳性和阴性样本中分别进行分析。HLA-C*06：02阳性样本中，与对照组相比，rs1250559_C在蒙古族PsV患者中的频率差异有统计学意义（χ2=5.47，P<0.05，OR=1.42）。而在HLA-C*06：02阴性样本中，其等位基因频率差异无统计学意义（P>0.05）。rs1250546_T在HLA-C*06：02阳性、阴性的样本中，等位基因频率差异无统计学意义。在汉族样本中，2个SNP在HLA-C*06：02阳性及阴性的PsV患者和对照组比较，等位基因频率差异无统计学意义（P>0.05），见表6。

表6 HLA-C*06：02与PsV患者ZMIZ1基因rs1250559_C、rs1250546_T相关性分析

3 讨论

银屑病是一种T细胞介导的慢性炎症性皮肤病，目前研究已发现许多银屑病相关性易感基因。ZMIZ1基因是位于染色体10q22.3上，通过编码PIAS家族蛋白，调节多种转录调控因子的活性，如雄激素受体（AR）、Smad3/Smad4、P53 等[6-8]。ZMIZ1 下游的转化生长因子（TGF）-β是一种有多种免疫抑制特性的多效性细胞因子，其对胚胎发育、器官形成、细胞的增殖、分化及凋亡有重要调节作用，其中Smad蛋白是TGF-β信号通路激活的关键点。TGF-β抑制许多生物学过程，包括T细胞增殖、T细胞分化为细胞毒性T淋巴细胞、辅助性T淋巴细胞和抗原提呈细胞的T细胞刺激功能[9-10]。而TGF-β在体外则能促进调节性T淋巴细胞的分化[11]。

目前，ZMIZ1基因上已有多个SNP位点被发现与多种疾病相关，包括多种皮肤病（银屑病[3]、白癜风[12]）、肿瘤（皮肤鳞状细胞癌[13]、前列腺癌[14]、乳腺癌[15]、直肠癌[16]等）、自身免疫性疾病（炎症性肠病）[17]、代谢性疾病（2型糖尿病）[18]、药物治疗效果相关（甲氨蝶呤治疗青少年特发性关节炎的治疗反应评估）等[19]。

本研究结果显示，蒙古族PsV患者中，rs1250559_C的频率（33.5%）高于对照组（27.7%），（OR=1.31）；rs1250546_T的频率（48.5%）高于对照组（43.4%），（OR=1.23）；而在汉族PsV患者中 rs1250559_C、rs1250546_T的频率与对照组相比差异无统计学意义。既往文献报道通过运用全基因组关联研究目录对欧洲白种人荟萃分析总结发现rs1250546_A（ZMIZ1） 与银屑病相关 （P=5.1×10-4，OR=1.10），rs1250559_A（ZMIZ1）也与银屑病的相关（P=4.58×10-6，OR=0.82），并且发现ZMIZ1是银屑病和克罗恩病的共同易感基因[3-4]。而在中国汉族人群中也发现了ZMIZ1与炎症性肠病的相关性[17]。

笔者进一步根据不同遗传模式下进行分析时发现，蒙古族PsV患者中rs1250546_T在显性遗传模式下显示有相关性，而rs1250559_C在隐性遗传模式下显示有相关性。这一结果提示2个SNP可能以不同的遗传模式影响银屑病发病风险。在以HLA-C*06：02阳性、阴性进行分层分析时发现，rs1250559_C在HLA-C*06：02阳性的蒙古族样本中与PsV有相关性，而在HLA-C*06：02阴性的蒙古族样本中，未发现其与PsV的相关性。而另一个SNP（rs1250546）在分层后未发现与蒙古族PsV的相关性。这一结果提示，rs1250559可能与HLAC*06：02存在交互作用，rs1250559_C和 HLAC*06：02阳性的共同存在可能增加了蒙古族PsV的易感性。而在汉族样本中，以等位基因、基因型、不同遗传模式、HLA-C*06：02分层分析均未发现2个SNP与PsV的相关性。ZMIZ1基因变异如何影响PsV易感性目前仍不能确定，通过实验笔者推测ZMIZ1基因与HLA-C*06：02可能存在交互作用，可增加银屑病的易感性。由于HLA-C*06：02是银屑病最强的遗传易感因素，推测ZMIZ1可能通过与HLA-C相互作用影响银屑病的易感性。

综上所述，本研究通过对ZMIZ1基因区域2个SNP（rs1250559、rs1250546）进行关联分析研究，证实了其与蒙古族PsV易感性相关，并且以不同的遗传模式影响银屑病易感性，并且与HLA-C*06：02可能存在相互作用，从而影响蒙古族PsV的易感性。未发现2个SNP与汉族PsV的相关性。结合既往研究，这些结果提示ZMIZ1基因与PsV的相关性在不同人群中可能存在遗传异质性。本研究仍存在一些不足之处：①由于样本量有限，有假阳性或者假阴性结果的可能，不能排除rs1250559、rs1250546与汉族PsV的相关性；②本研究仅分析了ZMIZ1基因的2个SNP，该基因区域可能还存在其他银屑病相关的易感变异；③这2个SNP并非编码区功能变异，其如何影响其基因功能以及如何影响免疫系统功能仍未知，需要进一步的功能学研究。