利用功能反应模型评价球孢白僵菌对东亚小花蝽捕食二斑叶螨的影响

陈亚丰, 王 甦, 邸 宁,*, 金道超

(1. 贵州大学昆虫研究所, 贵州山地农业病虫害重点实验室, 农业农村部贵阳作物有害生物科学观测实验站, 贵阳 550025;2. 北京市农林科学院植物保护环境保护研究所, 北京 100097)

利用天敌昆虫对害虫进行生物防治可有效避免化学投入品带来的害虫抗药性和环境污染等问题(陈学新, 2010)。不同天敌的混合释放可以在增加群落稳定性的同时减少天敌种群的自然衰退，因此天敌的联合应用对于降低虫害造成的产量损失具有潜在增效作用(Heimple and Mills, 2008; 李姝等, 2014)。目前，不同天敌的联合应用包括多种天敌昆虫混合释放和利用天敌昆虫携带生防菌进行防控增效，而天敌之间的兼容性是影响防治效果的重要因素(Chowetal., 2008; 吴圣勇等, 2019)。

白僵菌Beauveriaspp.是广谱性的昆虫病原微生物，可以寄生鳞翅目、鞘翅目、半翅目和膜翅目等15目149 科700多种昆虫和蜱螨类(季香云和杨长举, 2003)。白僵菌因具有寄主范围广、致病性较强等优点，已成为害虫生物防治中应用最为广泛的虫生真菌之一(高红等, 2011; 郭涵等, 2020)。然而白僵菌也有一定局限性，因为杀虫谱较广的病原微生物在杀死害虫的同时，也可能会对天敌昆虫产生负面影响(Ong and Vandermeer, 2015; 杨清碰和李莉, 2017; 吴圣勇等, 2019)。有研究表明，用白僵菌孢悬液(1×107孢子/mL)处理松墨天牛Monochamusalternatus寄生性天敌管氏肿腿蜂Sclerodermaguani7 d后，天敌死亡率高达100%(杨清碰和李莉, 2017)。然而Wu等(2016)研究表明施用白僵菌对捕食性天敌巴氏新小绥螨Neoseiulusbarkeri的种群密度没有影响；杨芷等(2020)发现白僵菌孢子对松毛虫赤眼蜂Trichogrammadendrolimi的羽化时间和羽化率等无不良影响。因此系统性地评价白僵菌对天敌的影响是白僵菌与天敌昆虫联合应用的前提。

二斑叶螨Tetranychusurticae是一种重要的世界性害螨，世代周期短，寄主范围广。由于化学药剂长期大量的不合理使用导致该螨对多种杀螨剂产生不同程度的抗性，因此通过生物防治来降低二斑叶螨的危害变得更加重要(宫亚军等, 2014)。 东亚小花蝽Oriussauteri作为一种重要的生防天敌(Wangetal., 2019)，在我国分布范围广、适应性强，其对叶螨、蓟马和粉虱等害虫的防治效果已在温室和田间得到广泛证实(蒋月丽等, 2011; 尹健等, 2013; Wangetal., 2014)。

目前针对白僵菌与小花蝽属天敌联合应用防治害虫的研究较少。Gao等(2012)研究表明，无论用白僵菌孢悬液直接施用于东亚小花蝽，还是用白僵菌处理过的西花蓟马Frankliniellaoccidentalis饲喂东亚小花蝽均不会对其生长发育造成影响，但该研究未评价白僵菌对东亚小花蝽捕食能力的影响。Shipp等(2003)研究表明美洲小花蝽O.insidiosus成虫不应与球孢白僵菌在温室中联合释放应用，然而该研究仅使用了单一浓度的孢子悬浮液。本研究通过比较经球孢白僵菌B.bassiana孢子粉与不同浓度的孢子悬浮液处理后的东亚小花蝽羽化率以及捕食二斑叶螨的功能反应模型评价白僵菌对东亚小花蝽的安全性，以期为东亚小花蝽与白僵菌温室联合释放应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

东亚小花蝽采自北京市农林科学院玉米试验田，在人工气候箱(三洋，MH351)(温度26±1℃，相对湿度60%±5%，光周期16L∶8D，光照强度800 lx)中饲养20代以上，所用饲养猎物为经紫外光照射30 min杀胚处理过的新鲜米蛾Corcyracephalonica卵。选取同日孵化的东亚小花蝽，待若虫生长至5龄第1天，随机选择作为试验材料，试验前饥饿处理12 h。

二斑叶螨雌成螨于2019年8月自北京市农林科学院玉米试验田采集，将分离鉴定后的200头雌成螨在温室(温度27±1℃, 相对湿度40%±5%)内用盆栽芸豆Phaseolusvulgaris饲养扩繁。扩繁过程中每隔10 d将带螨的叶片从芸豆苗剪下，转移到新的芸豆上，以保证叶螨食物充足。

供试球孢白僵菌菌种(菌株号: D1-5)由吉林省农业科学院提供，浓度为500亿个孢子/g。

1.2 不同球孢白僵菌处理的东亚小花蝽羽化率测定

试验包括以下处理：(1)空白对照，即未经处理过的东亚小花蝽5龄若虫；(2)阴性对照，东亚小花蝽5龄若虫用5 mL含0.05%吐温80(国药集团化学试剂有限公司)的无菌水浸泡5 s；(3)孢子粉处理，参照杨清碰和李莉(2017)的方法并加以改进，具体为将0.5 g球孢白僵菌孢子粉均匀撒在直径9 cm的培养皿中，让1头东亚小花蝽5龄若虫在培养皿上爬行5 min，平均每头小花蝽附着孢子数约为1×107个；(4)常规浓度孢悬液处理，即用5 mL推荐浓度1×107孢子/mL的孢悬液(吴圣勇, 2014)将东亚小花蝽5龄若虫浸泡5 s；(5)采用低浓度(5×103孢子/mL)孢悬液浸泡东亚小花蝽5龄若虫，方法同上。其中常规浓度和低浓度的球孢白僵菌孢悬液均由含0.05%吐温80的无菌水配制。孢子粉处理的东亚小花蝽带菌量为常规浓度孢悬液处理带菌量的2 000倍，常规浓度孢悬液处理的东亚小花蝽带菌量为低浓度孢悬液处理带菌量的2 000倍。东亚小花蝽经不同处理的带菌量计算方法如下：带菌量=(小花蝽处理后重量-小花蝽处理前重量)×浓度；各处理下选取15头东亚小花蝽5龄若虫的数值取平均值。

将上述5种处理的东亚小花蝽5龄若虫置于透明的塑料养虫盒中，每盒20头。养虫盒为直径10 cm、高8 cm的圆柱形。为保证养虫盒通风，盒盖用直径为9 cm的100目纱网封住。每个养虫盒中放入足量米蛾卵(处理同1.1节)作为东亚小花蝽的食物。 5 d后统计东亚小花蝽成虫羽化率(羽化率=羽化数/20×100%)。各处理重复5次。

1.3 不同球孢白僵菌处理的东亚小花蝽5龄若虫对二斑叶螨的捕食能力测定

东亚小花蝽处理同1.2节。猎物密度设置为10, 20, 30, 40, 50, 60和70头/皿共7个梯度水平。用毛笔将相应数量的二斑叶螨雌成螨转移至直径9 cm的培养皿中，然后将1头饥饿处理12 h的东亚小花蝽5龄若虫放入培养皿，盖上皿盖后用封口膜(BEMIS, 美国)封住，以防止东亚小花蝽和二斑叶螨逃逸。随后将培养皿置于人工气候箱(条件同1.1节)，24 h后观察统计各猎物密度及不同处理下存活的叶螨数量，并计算东亚小花蝽的捕食量(捕食量=初始叶螨数量-存活叶螨数量)。以只放入叶螨而不放入东亚小花蝽的培养皿为空白对照来校正实际的捕食量(实际捕食量=观测捕食量-空白对照死亡量)。各处理重复10次。

1.4 不同球孢白僵菌处理的东亚小花蝽对二斑叶螨的捕食功能反应模型分析

1.5 不同球孢白僵菌处理的东亚小花蝽对二斑叶螨的搜寻效应分析

利用1.4节中拟合Holling II型功能反应模型所得参数，对东亚小花蝽5龄若虫对二斑叶螨雌成螨的搜寻效应依公式进行估算:S=a′/(1+a′ThN)。式中S为搜寻效应值，N为猎物密度，a′及Th同Holling II型功能反应模型方程。

1.6 数据分析

采用R(v.4.0.0)对东亚小花蝽的校正捕食量与猎物密度和处理之间的关系进行双因素方差分析(two-way ANOVA；其中东亚小花蝽的校正捕食量为因变量，猎物密度和处理为自变量，考虑自变量之间的交互作用)，评估处理和猎物密度以及它们的交互效应对东亚小花蝽5龄若虫捕食量影响的显著性。利用SPSS 26.0(IBM)进行卡方检验来验证不同处理的东亚小花蝽对二斑叶螨的取食是否拟合Holling II功能反应模型。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验白僵菌处理对东亚小花蝽羽化率影响的显著性，分析之前先对羽化率百分比数据进行反正弦平方根转换。采用Tukey HSD法比较东亚小花蝽羽化率在不同处理之间、同一猎物密度下捕食量的差异显著性。所有分析中差异显著性水平设置为P<0.05。

2 结果

2.1 球孢白僵菌孢悬液和孢子粉处理对东亚小花蝽羽化率的影响

球孢白僵菌孢悬液(常规浓度: 1×107孢子/mL; 低浓度: 5×103孢子/mL)和孢子粉(1×107孢子/头)处理对东亚小花蝽羽化率具显著影响(F=11.121,df=4, 24,P<0.001)。未羽化的东亚小花蝽在羽化前死亡。其中用孢子粉处理的东亚小花蝽5龄若虫，其成虫羽化率最低，其余4组间无显著性差异(P>0.05)(图1)。

图1 球孢白僵菌孢悬液和孢子粉处理对东亚小花蝽成虫羽化率的影响Fig. 1 Effect of spore suspension and spore powder ofBeauveria bassiana on the emergence rate ofOrius sauteri adultsBC: 空白对照Blank control; NC: 阴性对照(含0.05%吐温80的无菌水)Negative control (sterile water containing 0.05% Tween-80); SSL: 球孢白僵菌孢悬液(5×103孢子/mL)B. bassiana spore suspension (5×103 conidia/mL); SSR: 球孢白僵菌孢悬液(1×107孢子/mL) B. bassiana spore suspension (1×107 conidia/mL); SP: 球孢白僵菌孢子粉(1×107孢子/头) B. bassiana spore powder (1×107 conidia/individual). 下同The same below. 东亚小花蝽5龄若虫经2种不同浓度的球孢白僵菌孢悬液(常规浓度: 1×107孢子/mL; 低浓度: 5×103孢子/mL)和孢子粉(1×107孢子/头)处理，5 d后统计成虫羽化率。图中数据为平均值±标准误；柱上不同字母表示羽化率在不同处理间差异显著(P<0.05, Tukey HSD法)。The 5th instar nymphs of O. sauteri were treated with two different concentrations of B. bassiana spore suspensions (routine concentration: 1×107 conidia/mL; low concentration: 5×103 conidia/mL) and spore powder (1×107 conidia/individual). The adult emergence rate was counted at 5 d after treatment. Data in the figure are means±SE. Different letters above bars indicate significant difference (P<0.05, Tukey HSD test).

2.2 球孢白僵菌孢悬液和孢子粉处理的东亚小花蝽5龄若虫对二斑叶螨雌成螨的捕食能力

东亚小花蝽5龄若虫对二斑叶螨雌成虫的捕食量受猎物密度、处理以及猎物密度与处理的交互作用影响显著(猎物密度:F=489.061,df=6, 315,P<0.001; 处理:F=44.041,df=4, 315,P<0.001; 猎物密度×处理:F=2.724,df=24, 315,P<0.001)。除猎物密度为10头外，球孢白僵菌孢子粉处理的东亚小花蝽5龄若虫对二斑叶螨雌成虫的捕食量均显著低于阴性对照和空白对照(P<0.05)。在猎物密度为50头/皿时，2个浓度孢悬液处理中东亚小花蝽5龄若虫对二斑叶螨雌成虫的捕食量均显著低于空白对照(P<0.05)，但与阴性对照无显著差异(P>0.05)；但在其他6个猎物密度下，2个浓度孢悬液处理中东亚小花蝽5龄若虫对二斑叶螨雌成虫的捕食量与空白和阴性对照均无显著差异(P>0.05)(图2)。

图2 球孢白僵菌孢悬液和孢子粉处理的东亚小花蝽5龄若虫在二斑叶螨雌成螨不同密度下的捕食量Fig. 2 Predation amounts of female adults of Tetranychus urticae by the 5th instar nymphs of Orius sauteri treatedwith spore suspension and spore powder of Beauveria bassiana under different prey densities图中数据为平均值±标准误；柱上不同字母表示在同一猎物密度下不同处理间捕食量差异显著(P<0.05, Tukey HSD法)。Data in the figure are means±SE. Different letters above bars indicate that the predation amounts were significantly different among treatments under the same prey density (P<0.05, Tukey HSD test).

2.3 白僵菌孢悬液和孢子粉处理的东亚小花蝽对二斑叶螨雌成螨的捕食功能反应模型

球孢白僵菌孢悬液(常规浓度:1×107孢子/mL; 低浓度: 5×103孢子/mL)和孢子粉(1×107孢子/头)处理的东亚小花蝽5龄若虫对二班叶螨雌成螨的捕食能力均符合Holling Ⅱ型功能反应(R2>0.9,P>0.05)。表1中不同处理下东亚小花蝽的实际捕食量与理论值差异均不显著(P>0.05)。其中低浓度孢悬浮液处理的东亚小花蝽5龄若虫对二斑叶螨雌成虫的理论日最大捕食量最高(略高于空白对照组)，猎物处理时间最短；而常规浓度孢悬浮液处理的东亚小花蝽5龄若虫对二斑叶螨雌成虫的理论日最大捕食量低于前者，猎物处理时间长于前者。此外，孢子粉处理的东亚小花蝽5龄若虫对二斑叶螨雌成虫的日最大捕食量最低，猎物处理时间最长。

2.4 球孢白僵菌孢悬液和孢子粉处理的东亚小花蝽5龄若虫对二斑叶螨雌成螨的搜寻效应

根据功能反应参数计算出不同处理、不同猎物密度下东亚小花蝽5龄若虫的搜寻效应指数(图3)。 在不同处理下，东亚小花蝽5龄若虫的搜寻效应随猎物密度的增加而呈线性趋势下降(空白对照:y=-0.0020x+0.7812；阴性对照:y=-0.0020x+0.7566；低浓度孢悬液:y=-0.0014x+0.6984；常规浓度孢悬液:y=-0.0037x+0.7870；孢子粉:y=-0.0029x+0.6500)。用低浓度孢子悬浮液处理的东亚小花蝽5龄若虫捕食二斑叶螨雌成螨时搜寻效应随猎物密度增加下降趋势最缓。

图3 球孢白僵菌孢悬液和孢子粉处理的东亚小花蝽5龄若虫在不同猎物密度下对二斑叶螨雌成螨的搜寻效应Fig. 3 The searching efficiency of the 5th instar nymphs of Orius sauteri treated with spore suspension and spore powderof Beauveria bassiana to the female adults of Tetranychus urticae under different prey densities

3 讨论

广谱性病原微生物通常会对天敌昆虫造成不良影响，从而限制其与天敌昆虫联合应用的防治效果(Ong and Vandermeer, 2015)。本研究结果中，用球孢白僵菌孢子粉处理后的东亚小花蝽成虫羽化率最低，理论日最大捕食量最低，单头猎物处理时间最长(表1)；与空白对照相比，孢子粉处理对东亚小花蝽5龄若虫对二斑叶螨的捕食量影响显著(图2)，这表明孢子粉对该天敌的捕食行为有不利影响。虽然经低浓度孢悬液处理后的东亚小花蝽5龄若虫对二

表1 球孢白僵菌孢悬液和孢子粉处理的东亚小花蝽5龄若虫对二班叶螨雌成螨的捕食功能反应模型Table 1 Functional response models of the 5th instar nymphs of Orius sauteri treated with spore suspension andspore powder of Beauveria bassiana preying on female adults of Tetranychus urticae

斑叶螨雌成螨的实际捕食量略低于空白对照，但该处理下的理论日最大捕食量高于空白对照，单头猎物处理时间最短，且搜寻效应指数随猎物密度升高下降趋势最缓(表1; 图3)。除球孢白僵菌孢子粉处理外，其余各处理下东亚小花蝽的羽化率无显著差异(图1)。因此，白僵菌对天敌的施用方式和浓度选择是影响联合应用防效的重要因素。

通过拟合功能反应模型，比较功能反应参数可以直观地了解高营养级的天敌昆虫对靶标害虫的控制潜能(王甦等, 2014)。本研究结果表明，经不同剂型和浓度球孢白僵菌处理后的东亚小花蝽5龄若虫对二斑叶螨雌成螨的捕食功能反应均符合Holling Ⅱ型圆盘方程(表1)，即捕食量随猎物密度的上升而上升，当猎物密度达到一定程度时捕食量不再增加。这与东亚小花蝽对草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda(代晓彦等, 2020; 孙贝贝等,2020)、桃蚜Myzuspericae(邢秀霞等, 2010)、西花蓟马F.occidentalis(张安盛等, 2008)和大豆蚜Aphisglycines(韩岚岚等, 2015)的捕食功能反应结果趋势一致。

白僵菌在实际应用过程中常需人工抛洒或机器施药，药液或菌粉喷洒于植物叶面，而害虫产卵一般主要在叶背，导致施用效率低等问题(杨芷等,2020)。而天敌昆虫具有极强的活动和搜寻能力，作为生物防治的一项重要组成部分，在农业可持续发展中具有显著的专业优势(张帆等, 2015)。Zhang等(2016, 2018)等用虫生真菌环链棒束孢Isariacateniannulata与尼氏真绥螨Euseiusnicholsi联合释放防治二斑叶螨，发现环链棒束孢的孢子能大量附着在二斑叶螨身体各部，侵入体内致其死亡，虽有少量孢子可附于尼氏真绥螨足上，有的孢子也能产生芽管，但不能侵入尼氏真绥螨体内(Zhangetal., 2018)；环链棒束孢与尼氏真绥螨联合较单一使用更能有效控制二斑叶螨田间种群(Zhangetal., 2016)。东亚小花蝽体型小、活动能力强，常出现在叶片背面和结构复杂的花里。通过天敌携带白僵菌，利用其主动搜索和扩散能力，能够在天敌捕食害虫的同时，将白僵菌携带至药液不易喷洒的地方，从而实现对害虫的持续防控，提高二者的应用效率(孙光芝等, 2004; Wuetal., 2016; 吴圣勇等, 2019)。本研究结果中低浓度球孢白僵菌孢悬液对东亚小花蝽的羽化率无显著影响(图1)，且与对照相比，其捕食能力未受影响(图2)，因此通过东亚小花蝽携带球孢白僵菌来防治二斑叶螨具有可行性。

本研究初步证明了低浓度球孢白僵菌孢悬液处理东亚小花蝽后，其羽化率以及对二斑叶螨雌成虫的捕食能力未受显著影响。与田间推荐浓度的球孢白僵菌孢悬液相比，该低浓度孢悬液对东亚小花蝽较为安全，表明二者联合应用防治二斑叶螨具有潜在的实用价值。本研究是在可控条件下开展的，而在田间白僵菌的毒力会受到多种因素的影响(季香云和杨长举, 2003; 仝亚娟等, 2010)，天敌的定殖是否受到影响仍有待进一步研究，所以需要进一步开展田间安全性和有效性评价试验来挖掘利用东亚小花蝽携带白僵菌的控害效果。

致谢感谢吉林省农业科学院徐文静老师提供球孢白僵菌菌种。