食管鳞状细胞癌中CK7蛋白表达及预后意义

张 磊，蒋冬先，黄 洁，栾丽娟，管瑛瑛，徐 磊，宿杰阿克苏，侯英勇

食管癌是我国主要的致死癌症之一，据报道2014年超过19.3万患者死于食管癌[1]。约90%新发食管癌病例的组织学类型是食管鳞状细胞癌[2]。近年来虽然手术、放疗、化疗等治疗手段不断改善，但食管鳞状细胞癌患者的预后并未改善，5年生存率约30%[3]。目前亟需寻找与食管鳞状细胞癌患者预后相关的分子标志物。

细胞角蛋白7(CK7)是Ⅱ型细胞角蛋白，常用作上皮来源肿瘤标志物，如肺腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌和肾细胞癌[4-8]。在鳞状细胞癌中，CK7表达较少。最近有研究[9]发现，食管鳞状细胞癌的部分区域存在CK7表达，且CK7表达与食管鳞状细胞癌患者预后存在一定的相关性。目前尚缺乏关于CK7表达在食管鳞状细胞癌的大规模分析。本文采用免疫组化ELPS法检测512例食管鳞状细胞癌中CK7的表达，分析其表达与临床病理特征及患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集2007年1月～2010年12月在复旦大学附属中山医院行食管癌根治术的512例患者的临床病理资料。患者术前均未接受放、化疗。所有病例均经两名资深病理医师再次复片确诊为食管鳞状细胞癌。收集的临床病理资料包括：患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤部位及肿瘤大小、分化情况、脉管及神经束侵犯和淋巴结转移等。pTNM分期依据第8版美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer, AJCC)pTNM分期标准。

1.2 免疫组化采用免疫组化ELPS法检测512例食管鳞状细胞癌组织中CK7的表达。操作步骤严格遵照试剂盒说明书进行，一抗CK7单克隆抗体(克隆号OV-TL 12/30，DAKO公司)稀释比1 ∶300，使用通灵免疫组化仪，组织切片常规脱蜡、水化，PBS缓冲液冲洗，一、二抗孵育，DAB显色，苏木精衬染，乙醇脱水干燥，中性树胶封固。以食管固有腺体着色为阳性内对照、淋巴细胞为阴性内对照，肿瘤组织阳性判断标准：CK7定位于细胞膜和细胞质，阳性着色呈棕黄色颗粒，阳性细胞数≥10%为阳性。

1.3 随访所有患者均通过电话或者复查随访。无瘤生存期(disease free survival, DFS)指从患者手术之日起至出现复发、转移、死于食管癌的时间或最后一次随访时间。总生存期(overall survival, OS)定义为手术后至患者死亡的时间或最后一次随访时间。

1.4 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。利用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank法进行显著性检验。预后影响因素的单因素及多因素分析采用Cox比例风险回归模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞状细胞癌的临床病理特征512例食管鳞状细胞癌中，男性420例，女性92例，男女比约为4.6 ∶1；年龄34～83岁(中位年龄61岁)。198例(38.6%)患者有吸烟史。肿瘤平均直径为3.3 cm，主要位于食管中下段。肿瘤高、中和低分化病例分别为20、288和204例。脉管和神经束侵犯率分别为22.3%和35.0%。淋巴结转移率为46.3%。Ⅰ+Ⅱ期患者283例，Ⅲ+Ⅳa期患者229例。

2.2 食管鳞状细胞癌中CK7的表达126例(24.6%)食管鳞状细胞癌中CK7蛋白阳性，免疫组化染色范围10%～100%(图1)。CK7表达与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小及肿瘤部位、脉管和神经束侵犯无相关性(P>0.05)。在低分化肿瘤中，CK7阳性率较高(32.4%)。无淋巴结转移组中CK7的阳性率(21.1%)低于有淋巴结转移组(28.7%)，差异有统计学意义(P=0.046)。Ⅰ+Ⅱ期组中CK7的阳性率(20.8%)低于Ⅲ+Ⅳ期组(29.3%)，差异有统计学意义(P=0.028，表1)。

图1 A.食管鳞状细胞癌细胞呈巢团状、梁索状浸润生长；B.食管鳞状细胞癌中CK7阴性,ELPS法；C.食管鳞状细胞癌中CK7阳性,ELPS法；D.食管鳞状细胞癌CK7弥漫阳性，ELPS法

表1 食管鳞状细胞癌中CK7表达与临床病理特征的关系

2.3 食管鳞状细胞癌中CK7表达与患者预后的相关性512例食管鳞状细胞癌中，患者1、3和5年的总体生存率分别为87.9%、54.2%和44.3%。Kaplan-Meier生存分析显示，CK7阴性和阳性组患者的中位DFS分别为41、24个月，中位OS分别为47、33个月，CK7阳性患者预后明显比CK7阴性患者差(DFS：P=0.016；OS：P=0.020)(图2A、B)。Cox单因素生存分析发现，肿瘤分化、脉管侵犯、神经束侵犯、pTNM分期和CK7阳性与患者的DFS和OS相关；多因素生存分析显示，pTNM分期是影响食管鳞状细胞癌患者预后的独立危险因素(表2，图2C、D)。进一步分析CK7阳性分别在Ⅰ+Ⅱ期组和Ⅲ+Ⅳ期组患者中的预后意义，结果显示，在Ⅰ+Ⅱ期食管鳞状细胞癌中，CK7阳性患者的DFS和OS较短(DFS：P=0.047；OS：P=0.023)，提示部分患者预后差。在Ⅲ+Ⅳ期食管鳞状细胞癌中，CK7阳性患者的DFS和OS与CK7阴性患者差异无显著性(DFS：P=0.631；OS：P=0.824)(图2E、F)。

图2 CK7表达、pTNM分期与食管鳞状细胞癌患者预后的相关性：A.CK7阳性患者的DFS较短；B.CK7阳性患者的OS较短；C.Ⅲ+Ⅳ期患者的DFS较短；D.Ⅲ+Ⅳ期患者的OS较短；E.Ⅰ+Ⅱ期食管鳞状细胞癌中CK7阳性患者DFS较短，在Ⅲ+Ⅳ期食管鳞状细胞癌中，CK7阳性患者的DFS与CK7阴性患者，差异无显著性；F.在Ⅰ+Ⅱ期食管鳞状细胞癌中，CK7阳性患者OS较短，在Ⅲ+Ⅳ期食管鳞状细胞癌中，CK7阳性患者的OS与CK7阴性患者差异无显著性有更恶性的生物学行为。需要进一步的研究来挖掘其具体的分子作用机制。

表2 食管鳞状细胞癌患者预后影响因素的单因素和多因素Cox分析

3 讨论

CK7常作为腺上皮的标志物，在鳞状上皮中的研究较少。目前有关CK7在食管鳞状细胞癌中的表达研究有限。2008年Yamada等[10]检测126例日本食管鳞状细胞癌中CK7的阳性率为22%。2013年Oue等[11]检测225例日本食管鳞状细胞癌患者的CK7阳性率为9%。2018年Xu等[12]检测610例中国食管鳞状细胞癌患者的CK7阳性率为10%。同年杨召阳等[9]检测190例中国食管鳞状细胞癌患者的CK7阳性率为15.3%。以往研究中CK7蛋白阳性率差异较大。以上两项日本的研究中，均选择10%肿瘤细胞阳性作为Cut off值。两项中国的研究中，分别选择25%和1%作为Cut off值。选择不同的Cut off值，将影响CK7在食管鳞状细胞癌中阳性率的判读。本实验发现，存在CK7着色的食管鳞状细胞癌组织中，阳性肿瘤细胞的比例为10%～100%，个别病例阳性肿瘤细胞的比例为1%～5%。故本实验选择10%作为Cut off值，CK7蛋白阳性率为24.6%。

本实验结果显示，CK7表达与肿瘤分化、淋巴结转移和pTNM分期相关。在肿瘤分化差、有淋巴结转移、pTNM分期较高的患者中，CK7阳性率较高。这些结果提示CK7蛋白阳性的肿瘤细胞存在较高的恶性程度。在正常食管黏膜中，CK7表达于黏膜固有层和黏膜下层的食管腺，不表达于表面鳞状上皮[4]。部分食管鳞状细胞癌细胞表达CK7，意味着细胞表达模式的改变，可能反映肿瘤的不同表型拥CK7表达与食管癌患者预后差存在相关性。以往研究认为CK7表达的预后意义在不同的TNM分期中存在差异。Yamada等[10]的研究结果显示，在78例Ⅰ+Ⅱ期食管鳞状细胞癌中，CK7阳性患者的总生存率较低；在48例Ⅲ+Ⅳ期食管鳞状细胞癌中，CK7阳性患者和阴性患者的总生存率差异无显著性。Oue等[11]的研究结果显示，在101例0+Ⅰ期食管鳞状细胞癌中，CK7表达与患者的DFS和OS无相关性；在124例Ⅰ+Ⅱ期食管鳞状细胞癌中，CK7阳性患者的DFS和OS较差。Xu等[12]的研究结果显示，在92例Ⅰ+Ⅱ期食管鳞状细胞癌中，CK7阳性患者的OS较短，Ⅲ+Ⅳ期食管鳞状细胞癌中CK7表达的预后意义未进行比较。杨召阳等[9]的研究未比较不同临床分期中CK7预后的差异。本实验比较分析了512例Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ期食管鳞状细胞癌中的CK7表达预后差异，结果发现，在283例Ⅰ+Ⅱ期患者中，CK7阳性患者的DFS和OS较差，在229例Ⅲ+Ⅳ期患者中，CK7表达与患者生存无相关性。进一步验证了CK7蛋白表达的预后意义主要体现在较早期的食管癌中，具体的分子机制尚需深入探究。食管癌的发生、发展是多因素共同作用的过程，在疾病进展过程中不断出现分子改变[13-14]。较晚期食管癌由于改变了分子的积累和相互作用，异常分子的生物学作用更加复杂[13]，异常分子之间的作用相互影响，单个分子的预后价值有限。

综上，本实验分析了食管鳞状细胞癌中CK7的表达，发现其与肿瘤分化差、有淋巴结转移、高临床分期相关。在Ⅰ+Ⅱ期食管鳞状细胞癌中，CK7表达与患者预后差相关。该结果有助于对Ⅰ+Ⅱ期患者进行预后的危险度分级，可能有助于这部分患者将来得到更合理的治疗方式。