胃癌组织中miR-107、AXIN2的表达及与预后的相关性

张肖丽，张月晓，李 萍，李炳庆，陈 健

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。其治疗首选手术切除，部分患者预后差，易复发转移，病死率高[1]，因此，研究胃癌发生、发展机制及与预后的相关因素，具有重要意义。微小RNA-107(microRNA-107, miR-107)与多种肿瘤的发生、发展相关。邹德胜等[2]的研究结果表明，miR-107在结直肠癌患者血清中的表达水平升高，且与结直肠癌的TNM分期相关。赵轲等[3]的研究结果表明，非小细胞肺癌组织中miR-107呈高表达，且与病理分化、肿瘤大小、淋巴结转移以及TNM分期呈正相关。轴抑制蛋白2(axis inhibition protein 2, AXIN2)是Wnt/β-catenin信号通路的重要调节因子，参与细胞增殖、分化、迁移、凋亡以及肿瘤的发生等生物学功能[4]。AXIN2在乳腺癌等多种肿瘤中均有表达，与肿瘤的发生、发展有关[5]。目前，关于miR-107与AXIN2同时在胃癌中的研究报道不多。本文采用免疫组化SP法检测miR-107和AXIN2在胃癌组织中的表达，探讨miR-107和AXIN2表达与胃癌患预后的关系，为临床和病理医师提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2015年1月～2017年5月在我院就诊并行手术治疗的65例胃癌患者的组织标本，同时取相应癌旁正常胃黏膜组织标本(距癌灶边缘至少5 cm)作为对照。所有入组病例经病理学诊断，并排除其他系统的恶性肿瘤，术前均未行任何抗肿瘤治疗，每份标本的临床和病理资料均完整。65例患者：TNM分期Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期26例；高分化12例，中分化28例，低分化25例；有淋巴结转移者31例，无淋巴结转移者34例；侵及浆膜27例，未侵及浆膜38例。术后对所有患者进行电话或门诊随访，随访日期截至2020年5月。本实验经我院伦理委员会批准，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒购自大连TAKARA公司。miR-107、AXIN2及内参基因U6、β-actin序列设计引物，由上海生物工程公司合成。AXIN2兔抗人多克隆抗体购自美国Abcam公司，SP、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.3 方法

1.3.1样品采集及保存 胃癌及正常胃黏膜组织标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，用于免疫组化染色。

1.3.2qRT-PCR法检测胃癌组织中miR-107和AXIN2 mRNA的表达 取收集的组织标本100 mg，研钵研碎后加TRIzol液，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，使用反转录试剂盒反转录得到cDNA，置于-20 ℃保存备用。采用qRT-PCR法检测miR-107的表达。miR-107、AXIN2及内参基因U6、β-actin，引物序列见表1。PCR反应条件：95 ℃，75 s；95 ℃，15 s；60 ℃，35 s；95 ℃，15 s；合计38个循环。每个样品设置3个复孔。反应结束后，miR-107和AXIN2 mRNA表达水平采用2-△△CT分析法进行计算。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3免疫组化 免疫组化染色采用SP法，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。石蜡切片二甲苯脱蜡，加热诱导抗原修复，3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶活性，10%山羊血清封闭后，加入AXIN2兔抗人多克隆抗体(稀释比1 ∶100)，于4 ℃过夜，DAB显色后苏木精复染。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。

1.3.4结果判断 显微镜下观察，每例标本随机观察5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，计算每个视野阳性细胞所占百分比。按阳性细胞数评分：<10%为0分，11%～30%为1分，31%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；按细胞染色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为2分。将两项评分结果相乘：0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性()，6分以上为强阳性()。将(+～)视为阳性。

2 结果

2.1 胃癌及正常胃黏膜组织中miR-107与AXIN2 mRNA的表达本组实验结果显示，miR-107在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常胃黏膜组织，两组相比差异有统计学意义(P<0.05)，AXIN2 mRNA在胃癌组织中的表达显著低于癌旁正常胃黏膜组织，两组相比差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 胃癌及癌旁正常胃黏膜组织中miR-107和AXIN2 mRNA的表达水平

2.2 胃癌及癌旁正常胃黏膜组织中AXIN2蛋白表达本组实验结果显示，AXIN2蛋白表达定位于细胞质或细胞膜(图1)，胃癌组织中AXIN2蛋白阳性率显著低于癌旁正常胃黏膜组织(P<0.05，表3)。

图1 A.AXIN2蛋白在胃癌组织中呈阴性，SP法；B.AXIN2蛋白在癌旁正常胃黏膜组织中呈阳性，SP法

表3 胃癌及癌旁正常胃黏膜组织中AXIN2蛋白表达

2.3 胃癌中miR-107和AXIN2表达与临床病理特征的关系本组以胃癌组织中miR-107表达的平均数，将胃癌患者分为高表达组(≥1.65)和低表达组(<1.65)，以AXIN2蛋白免疫组化染色结果，将胃癌患者分为AXIN2高表达组(染色结果为阳性)和AXIN2低表达组(染色结果为阴性)。结果发现miR-107、AXIN2表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期及浸润深度有关(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤大小和病变部位无关(P>0.05，表4)。

表4 胃癌中miR-107和AXIN2表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.4 miR-107和AXIN2表达与胃癌患者预后的关系随访截至2020年5月31日，术后随访6～36个月，无失访病例，随访期间死于胃腺癌者24例，Kaplan-Meier生存分析显示，miR-107高表达者总生存率为24.07%，低表达者总生存率为64.48%，miR-107高表达组胃癌患者3年生存率显著低于低表达组患者(χ2=8.486，P<0.05，图2A)。AXIN2高表达者总生存率为64.39%，低表达者总生存率为28.73%，AXIN2高表达组胃癌患者3年生存率显著高于低表达组患者(χ2=5.729，P<0.05，图2B)。

图2 Kaplan-Meier生存分析：A.miR-107表达与患者预后的关系；B.AXIN2表达与患者预后的关系

2.5 胃癌患者预后影响因素分析Cox单因素分析结果显示，低分化、淋巴结转移、TNM分期、miR-107高表达、AXIN2低表达是影响胃癌患者不良预后的危险因素(P<0.05)。性别、年龄、肿瘤直径、浸润深度与胃癌患者预后无关(P>0.05)；多因素分析结果显示，淋巴结转移、TNM分期、miR-107高表达、AXIN2低表达是影响胃癌患者不良预后的独立危险因素(P<0.05，表5)。

2.6 胃癌组织中miR-107和AXIN2 mRNA表达的相关性胃癌组织中miR-107和AXIN2 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.607，P<0.001，图3)。

图3 胃癌组织中miR-107和AXIN2 mRNA表达的相关性

3 讨论

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率呈逐年上升趋势，随着医疗水平的提高，胃癌的诊治水平有不同程度地提高，但部分患者的预后情况和生活质量却未得到有效改善，因此早期预判胃癌患者的预后，寻找胃癌有效的生物学靶点具有重要意义[6-7]。

miR-107在细胞的生长、分化、增殖、发育、凋亡和代谢等多种过程中发挥重要作用，其表达失衡与胃癌的发生密切相关，可作为疾病诊断的分子标志物[8-9]。余南荣等[10]的研究结果表明，miR-107在胃癌细胞中的表达上调，可通过靶向Notch2促进MMP-9的表达，促进胃癌细胞的迁移和侵袭。于志红等[11]的研究结果表明，miR-107在胃癌组织中高表达，miR-107可通过负向调控PCDH17促进上皮-间质转化，进而增强胃癌细胞的迁移及侵袭能力。本实验结果显示，在胃癌组织中miR-107表达水平高于癌旁正常胃黏膜组织，其表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期及浸润深度有关，提示miR-107在胃癌的发展过程中可能发挥促进肿瘤细胞增殖、侵袭的作用，进一步分析结果显示，miR-107高表达组胃癌患者3年生存率显著低于低表达组患者，提示miR-107高表达可能增强胃癌细胞迁移及侵袭能力，调控肿瘤发展进而影响患者预后情况。

AXIN2作为一种信号调控因子，与多种肿瘤，如肝癌、结肠癌、肺癌等的发生、发展密切相关[12]。张涛等[13]的研究结果表明，胰腺癌细胞株中AXIN2的表达与正常胰腺细胞相比表达下调，在侵袭能力越高的癌细胞株中表达越低，提示起抑癌基因作用。本实验结果显示，胃癌组织中AXIN2蛋白阳性率显著低于正常胃黏膜组织，进一步分析结果显示，低分化胃癌组织中AXIN2表达水平显著低于中+高分化者，有淋巴结转移者的AXIN2表达水平显著低于无淋巴结转移者，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者的AXIN2表达水平显著低于Ⅰ+Ⅱ期者，侵及浆膜者的AXIN2表达水平显著低于未侵及浆膜者，提示AXIN2与胃癌的发生、发展相关。生存分析显示，AXIN2高表达组胃癌患者3年生存率显著高于低表达组患者，提示AXIN2表达缺失的患者肿瘤分化差、预后差，易发生浸润和转移，AXIN2可能通过调控肿瘤发展影响患者预后。

进一步分析发现，淋巴结转移、TNM分期、miR-107高表达、AXIN2阴性是影响胃癌患者不良预后的独立危险因素，提示miR-107、AXIN2可能作为评估胃癌患者不良预后的生物标志物。然而两者在胃癌中的表达关系及具体作用机制尚不清楚，Zhang等[14]研究结果表明，miR-107在肝癌组织和细胞系中显著上调，AXIN2的表达受miR-107负调控，miR-107可以通过靶向AXIN2促进肝癌细胞增殖。本实验结果显示，胃癌组织中miR-107与AXIN2表达水平呈负相关，因此本实验推测miR-107可能靶向作用于AXIN2促进胃癌细胞增殖，共同参与胃癌的发生、发展。

综上所述，胃癌组织中miR-107高表达，AXIN2低表达，且与肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期、浸润深度和患者预后有关，可能作为胃癌患者预后评估的分子标志物。但两者在胃癌中的具体作用机制仍需扩大样本量深入探讨。