21种天然产物对小麦根腐病菌的抑菌活性

张 博，张悦丽，马立国，祁 凯，刘 苹，李长松，齐军山

（1山东省农业科学院植物保护研究所/山东省植物病毒学重点实验室，济南250100；2山东省农业科学院农业资源与环境研究所，济南250100）

0 引言

小麦根腐病是由多种土壤传播病原菌单独或混合侵染引起的重要病害，在小麦整个生育期均可发生，导致小麦减产，一般在20%～30%，严重时达50%以上[1]。该病主要病原是多种镰刀菌和小麦根腐蠕孢菌。近些年，腐霉菌导致的根腐病日趋频繁，小麦出苗期造成缺苗断垄，在分蘖和返青拔节期造成植株萎蔫矮化，生长不良，严重时引起根部和茎基部腐烂，造成植株枯死，产量降低[2-4]。目前，该病害的防治主要利用内吸性杀菌剂为活性成分的种衣剂进行种子包衣，或利用三唑类杀菌剂进行拌种，防治效果明显且药效能持续至拔节期[5-6]，但化学制剂的长期和超量使用，造成了土壤中有益微生物的种群的破坏，重金属超标等环境污染问题[7]。因此，生物防治倍受国内外学者关注，植物提取物等天然物质研究应用得到发展，国外报道无患子果皮提取物皂苷对苹果黑星病菌(Venturia inaequalis)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)具有很好的抑菌活性[8]；石榴皮提取物能够抑制橄榄炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)菌丝生长且防病效果明显[9]；另有研究发现白芥子的水提取物中的Pure Yellow Mustard and Tillecur对Fusarium graminearum抑制效果显著，浓度为1%时完全抑制病菌菌丝生长[10]；国内研究发现大黄、博落回和狼毒提取物对4种病原细菌的抑菌活性显著[11]；博落回、木醋酸、八角、丁香、细辛醚、石菖蒲6种植物提取物对番茄4种主要病害病原菌的抑制率达到60%以上[12]；生姜、花椒、八角和辣椒提取物对荞麦立枯病菌的抑制效果显著，抑制率能达75%以上[13]。本研究针对小麦根腐病的病原菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、刺腐霉菌(Pythium spinosum)和小麦根腐离蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)，收集21种天然抑菌物质，研究其对3种病原菌的抑制活性，为拓宽该病害生物防治的新思路提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及小麦品种

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、刺腐霉菌(Pythium spinosum)和小麦根腐离蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)，由本研究室分离、纯化、鉴定并保存。

1.2 供试天然物质

大黄素、白藜芦醇、青蒿素、槲皮素、芹菜素、反式细辛醚、顺式细辛醚从抑菌植物中提取获得（本课题组对抑菌成分分离并鉴定）。

供试精油为薰衣草油、肉桂油、月桂油、丁香酚油、天竺葵油、薄荷酮油、桉树油、香茅油、葡萄籽油、迷迭香油、野菊精油、柠檬精油、茶树油、柚皮苷精油，均为单方精油，购自上海香汇生物科技有限公司。

1.3 室内抑菌活性测定

采用菌丝生长法测定[14-19]：初次筛选按照100 mg/L浓度进行，选出有效天然物质；二次筛选将有效天然物质与灭菌PDA培养基均匀混合，配制成不同浓度梯度，倒入培养皿（直径9 cm）中制成含药培养基平板，灭菌水作对照，每浓度重复3次。在预培养的禾谷镰刀菌、刺腐霉菌和小麦根腐离蠕孢菌菌落边缘打取菌饼（直径0.5 cm），挑出置于PDA平板中间，分别在25℃（刺腐霉菌）和28℃（禾谷镰刀菌和离蠕孢菌）的暗培养7～10天，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率并运用DPS进行数据处理分析，得到EC50值。

2 结果与分析

2.1 21种天然产物对小麦根腐病菌的抑菌活性初筛

将天然产物（需用丙酮溶解），按照100 mg/L浓度与PDA培养基混匀，进行抑菌活性测定，结果如图1所示。

由图1可知，21种天然产物对小麦根腐病菌抑菌活性具有显著差异性，其中，白藜芦醇抑菌活性显著，对禾谷镰刀菌抑制率为18.75%，刺腐霉菌抑制率为85%，对离蠕孢菌抑制率为75%；其次是顺式细辛醚，对禾谷镰刀菌抑制率为56.25%，对刺腐霉菌抑制率为62.5%，对离蠕孢菌抑制率为56.2%；反式细辛醚对禾谷镰刀菌抑制率为51.25%，对刺腐霉菌抑制率为37.5%，对离蠕孢菌抑制率为62.5%；丁香酚对禾谷镰刀菌和刺腐霉菌抑制率均为37.5%，对离蠕孢菌抑制率为71.25%；薰衣草精油对3种病原菌均无抑菌活性；就小麦根腐病菌对天然产物的敏感程度而言，禾谷镰刀菌对顺式细辛醚最敏感，其次是反式细辛醚；刺腐霉菌对白藜芦醇最敏感，其次是顺式细辛醚和柠檬精油；离蠕孢菌对白藜芦醇最敏感，其次是丁香酚。因此，说明小麦根腐病菌对21种天然产物的敏感程度同样具有显著差异性。

图1 不同天然抑菌产物对小麦根腐病菌的抑制效果

2.2 天然产物对禾谷镰刀菌抑菌EC50值测定

依据初筛结果，设计浓度梯度，顺式细辛醚为250、100、75、50、10 mg/L，反式细辛醚为 500、250、100、75、50、10 mg/L，分别结果如表1所示。

表1 天然产物对禾谷镰刀菌的抑菌活性

由图表可以看出，反式细辛醚抑菌活性明显，EC50值为69.9972 mg/L，顺式细辛醚效果不显著，EC50值为130.2344 mg/L（图2、图3）。

图2 反式细辛醚对禾谷镰刀菌的抑菌活性

图3 顺式细辛醚对禾谷镰刀菌的抑菌活性

2.3 天然产物对刺腐霉菌抑菌EC50值测定

依据初筛结果，设计浓度梯度，白藜芦醇为100、75、50、10、5 mg/L，顺式细辛醚为250、100、75、50、10 mg/L，柠檬精油为500、250、100、50、10、5 mg/L，如表2所示。

表2 天然产物对刺腐霉菌的抑菌活性

由表可以看出，白藜芦醇对刺腐霉菌有明显抑菌活性，EC50值为24.4683 mg/L，其次是顺式细辛醚和柠檬精油效果较好，EC50值分别为71.0284 mg/L和79.8388 mg/L。

2.4 天然产物对离蠕孢菌抑菌EC50值测定

依据初筛结果，设计浓度梯度，将白藜芦醇为250、100、50、10、5 mg/L，丁香酚为200、100、50、10、1、0.5 mg/L。结果如表3所示。

表3 天然产物对离蠕孢菌的抑菌活性

由图表可以看出，丁香酚对离蠕孢菌有明显抑菌活性，EC50值为14.0664 mg/L，其次是白藜芦醇，EC50值为22.0968 mg/L。

3 讨论与结论

目前，国家大力倡导化学农药减施技术研究，植物提取物等天然产物在病害防治方面的研究和应用得到进一步提升，例如张亮等[20]测定了4种植物提取物对茶炭疽病菌抑制效果，结果表明芦柑皮抑制效果显著，EC50值为8.981 mg/L，艾蒿对分生孢子的抑制率为85.54%；张格杰等[21]测定26种植物乙醇提取物对植物病原菌的抑菌活性，发现黄花草木樨、艾草、铁杆蒿和黄花蒿抑菌效果好可应用于无公害植物源杀菌剂的开发；沈佳鑫等[22]研究发现山茶叶提取物对苹果腐霉病菌和小麦赤霉病菌抑制率在80%以上，可应用于无公害植物源杀菌剂的开发；杨婷[23]研究发现天然产物香芹酚、丁香酚、异丁香酚、枯茗醛、百里香酚对炭疽菌和链格孢有较好的抑菌活性，其中香芹酚抑菌活性最强，IC50分别为40.89 mg/L和18.19 mg/L。同时，在小麦根腐病防治方面，发现黄瑞香提取物对Fusarium graminearum有很好的效果[24]；苍耳提取物对小麦根腐病菌也有较好的抑制作用[25]；张维库等[26]发现牛心朴子所产生的生物碱能够很好地抑制小麦根腐病菌的生长。本研究基于国内外学者研究的基础上，较全面的收集天然产物，有针对性的筛选出对3种小麦根腐致病菌分别具有抑菌活性的天然产物，尤其是刺腐霉防治方面研究在国内鲜有报道，为小麦根腐病生物防治具有指导意义，在协同化学防控小麦根腐病和开发新型植物源农药提供参考依据。同时，天然产物也具有一定的局限性，例如生物提取量较低、很多研究局限在室内研究阶段、在田间的持效性较短及田间多方因素对防效的影响等均是今后需要进一步探索研究的新方向。

图4 白藜芦醇对离蠕孢菌的抑菌活性

图5 丁香酚对离蠕孢菌的抑菌活性

本文研究了21种天然产物对小麦根腐病的主要病原菌禾谷镰刀菌、刺腐霉和小麦离蠕孢菌的抑菌活性，明确了天然产物反式细辛醚、白藜芦醇、丁香酚对3种病原菌具有显著抑菌活性，其中，反式细辛醚对禾谷镰刀菌活性显著，EC50值为69.9972 mg/L；白藜芦醇对刺腐霉菌活性显著，EC50值为24.468 mg/L；丁香酚对离蠕孢菌活性显著，EC50值为14.0664 mg/L。同时，说明了小麦根腐病菌对21种天然产物的敏感程度同样具有显著差异性，例如：白藜芦醇抑菌活性对3种病原菌的抑制率分别为18.75%、85%和75%；反式细辛醚对3种病原菌的抑制率分别为51.25%、37.5%和62.5%；丁香酚对禾谷镰刀菌和刺腐霉菌抑制率均为37.5%，对离蠕孢菌抑制率为71.25%；薰衣草精油对3种病原菌均无抑菌活性。因此，要有针对性的选择天然抑菌物质，提高小麦根腐病的生物防治效果。