基于HS-SPME-GC-MS法分析春生田头菇子实体不同部位挥发性成分

陆 欢，徐 宁，刘建辉，王小艳，夏义良

（1.上海市农业科学院 食用菌研究所/农业农村部应用真菌资源与利用重点开放实验室/国家食用菌工程技术研究中心/上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201403；2.湖南省食用菌研究所，湖南 长沙 410013；3.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210023）

田头菇（Agrocybe praecox），又名春生田头菇，通常生长于林地或草地，在洞庭湖流域常生长在芦苇丛中或芦苇湿地附近，当地人称其为芦苇菇，是一种丰富营养、口感独特、风味浓郁、高蛋白质低脂肪、高钾低钠的食用菌[1-3]，具有很高的食用药用和商业价值。目前报道已知的田头菇属有近百种，我国记录的有十多种[4-7]，大部分已成功驯化并实现了人工栽培。

顶空固相微萃取是20世纪90年代新发展起来的一种用于食品风味物质分析检测的技术，通过顶空固相微萃取法结合气相色谱-质谱联用（head space solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GCMS）技术对挥发性成分进行测定和分析[8-9]，可以为挥发性成分的鉴定提供依据。该方法具有更高的准确度和更好的重复性，在挥发性成分分析方面已得到广泛利用。殷朝敏[10]等利用此方法测定出平菇、香菇、双孢蘑菇金针菇和杏鲍菇鲜品中关键挥发性风味成分；李文[11]等利用该方法综合评价了柱状田头菇子实体挥发性成分；李晔[12]通过该方法分析了灰树花中的挥发性成分以及在草菇、竹荪、榆黄蘑、糙皮侧耳、秀珍菇、红平菇、美味牛肝菌、羊肚菌、猴头菇、双孢蘑菇等方面的应用[13-20]。

作者采用顶空固相微萃取法结合气相色谱-质谱联用技术，通过对冷冻干燥-超微粉碎制得春生田头菇干燥样品进行挥发性成分测定，探究春生田头菇子实体菌盖和菌柄中的挥发性成分物质。通过分析比较春生田头菇中主要挥发性物质，为春生田头菇后续综合开发利用提供新的方向，也为富集有效活性成分的春生田头菇新品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

作者使用的材料采集于洞庭湖大通湖区芦苇湿地，野生菌株通过组织分离、驯化得到纯菌株，再在岳阳市湘阴县人工栽培获得的田头菇子实体。驯化菌株保存于湖南省食用菌研究所，菌株ITS的GenBanK登录号为MN475785。取田头菇的菌盖和菌柄进行试验。

GC/MS Solution色谱工作站和Thermo NIST MS Search2.3质谱数据库、Thermo 1300气相色谱-质谱联用仪：Thermo公司产品；固相微萃取器手柄、30/50μm DVB/PDMS固相微萃取纤维头：Supelco公司产品；顶空萃取瓶：上海安谱实验科技股份有限公司产品；FD-2C真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司产品；XDW-15B低温超微粉碎机：济南达微机械有限公司产品；MS-TS分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱：苏州江东精密仪器有限公司产品。

1.2 样品制备

先将田头菇鲜品置于烘干机中低温烘干，再将菌盖和菌柄分开，分别经超微粉碎机粉碎，置于-80℃冰箱中24 h后取出，放入真空冷冻干燥机中48 h后制得干燥样品，再将菌盖和菌柄样品分别过100目筛，置于避光阴凉处密封保存。精密称取菌盖和菌柄样品各0.1 g置于10 mL顶空萃取瓶中，隔垫密封待测。

1.3 萃取方法

称取适量样品，于顶空瓶中，加入饱和氯化钠，压盖，置于80℃水浴中平衡20 min，再将固相微萃取针扎进顶空中，继续放入80℃水浴中20 min，待上机解析5 min。

1.4 GC-MS条件

TG-5色谱柱（30.0 m×0.25μm，0.25 mm，赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品）；柱升温程序：初始温度60℃，保持5 min，以3.5℃/min升至100℃，保持5 min，再以8℃/min升至200℃，保持5 min；再以15℃/min升至280℃，保持15 min；进样口温度250℃；进样量1μL，载气流量1.2 mL/min；载气为高纯He（含有量99.999%）；进样方式：不分流。

电子轰击离子源（EI源）；离子源温度150℃，接口温度280℃；电子能量70 eV；灯丝发射电流200μA；质荷比扫描范围：35～350；质谱图利用NIST谱库进行检索比对和CAS编码查询，并结合有关文献进行鉴定。

2 结果与分析

春生田头菇子实体菌盖和菌柄的挥发性成分GC-MS分析经过NIST.17质谱数据库检索，从各离子的相对峰度等方面进行比对，选取相似度80以上的化合物，用面积归一法对各部位色谱峰占总峰面积百分比进行计算，共鉴定出79个化合物。其中，菌盖和菌柄分别鉴定出48种和47种挥发性物质，分别占总挥发性物质的60.76%和59.45%。

2.1 春生田头菇子实体菌盖中挥发性化合物及分析

春生田头菇子实体菌盖总离子流图谱见图1，所检测出的48种挥发性物质中（见表1），含有烷类11种，酮类8种，酯类6种，醛类5种，苯胺类3种，酸类2种，醇类2种，酚类2种，酰胺类2种，烯烃类1种，呋喃类1种，吡嗪类1种，胺类1种，其他类3种。烷类化合物为整个挥发性化合物主要成分，占总比例22.92%，其次为酮类、酯类化合物，分别占16.67%、12.50%；醛类、苯胺类化合物分别占8.33%、6.25%。酸类、醇类、酚类和酰胺类化合物均占4.17%。烷类化合物主要为十甲基环五硅氧烷、十二甲基环六硅氧烷和八甲基环四硅氧烷，相对质量分数分别为0.058%、0.051%、0.027%；酮类化合物主要为2-甲基-3-庚酮和1-丁基-2，5-吡咯烷二酮，相对质量分数分别为1.000%、0.027%；酯类化合物主要为醋酸-2-乙基己酯和丙位壬内酯，相对质量分数分别为0.039%、0.036%；醛类化合物主要为苯甲醛，相对质量分数为0.022%；苯胺类化合物主要为4'-甲氧基甲酰苯胺，相对质量分数为0.041%；酸类化合物主要为苯乙酸，相对质量分数为0.029%；醇类化合物主要为2-乙基己醇，相对质量分数为0.022%；酚类化合物主要为3-烯丙基-6-甲氧基酚，相对质量分数为0.073%；酰胺类化合物主要为N-异戊基乙酰胺，相对质量分数为0.017%，烯烃类化合物为1，3-联二苯-1-（三甲基硅氧基）-庚烯，相对质量分数分别为0.005%；呋喃类化合物主要为2-戊基呋喃，相对质量分数为0.014%；吡嗪类化合物为2-乙基-3，5-二甲基吡嗪，相对质量分数为0.015%；胺类化合物主要为（4-乙氧苯基）乙胺，相对质量分数为0.039%；其他化合物为二甲胺嗪、4-乙基-1-甲基-2-吡唑啉和3，5-二羟基戊苯，相对质量分数分别为0.007%、0.010%、0.007%。

图1 春生田头菇子实体菌盖总离子流图谱Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile compositions of the pileus of Agrocybe praecox

2.2 春生田头菇子实体菌柄中挥发性化合物及分析

春生田头菇子实体菌柄总离子流图谱见图2，所检测出的47种挥发性物质中（见表2），含有烷类7种，酯类7种，酸类6种，酮类4种，酰胺类4种，醛类3种，腈类2种，吡唑啉类2种，胺类2种，烯烃类1种，酚类1种，嘧啶类1种，蒽醌类1种，吲哚类1种，呋喃类1种，其他类4种。烷类和酯类化合物为整个挥发性化合物主要成分，均占总比例14.89%，其次为酸类、酮类、酰胺类化合物，分别占12.77%、8.51%、8.51%；醛类化合物占6.38%。烯烃类、腈类、吡唑啉类和胺类化合物均占4.26%。烷类化合物主要为硅二醇乙烷、十二甲基环六硅氧烷和十甲基环五硅氧烷，相对质量分数分别为1.32%、0.76%、0.57%；酯类化合物主要为亚油酸乙酯和棕榈酸乙酯，相对质量分数分别为0.71%、0.17%；酸类化合物主要为乙酸、苯乙酸和棕榈酸，相对质量分数分别为0.87%、0.18%、0.13%；酮类化合物主要为2-甲基-3-庚酮和3，3-二甲基-1-吡咯烷-1-丁酮，相对质量分数分别为1.00%、0.15%；酰胺类化合物主要为N-苄基-N-乙基-对异丙基苯甲酰胺和N-（3-甲基丁基）乙酰胺，相对质量分数分别为0.55%、0.13%；醛类化合物主要为苯甲醛，相对质量分数为0.10%；腈类化合物主要为5-氨基-7-（4-甲氧基-苯基）-2苯基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-6-腈，相对质量分数为0.06%；吡唑啉类化合物主要为4-乙基-1-甲基-2-吡唑啉，相对质量分数为0.06%；胺类化合物主要为（4-乙氧苯基）乙胺，相对质量分数为0.05%；烯烃类化合物主要为4-叔丁氧基苯乙烯，相对质量分数为0.09%；酚类化合物为3-烯丙基-6-甲氧基酚，相对质量分数为0.20%；嘧啶类化合物为4-羟基嘧啶，相对质量分数为0.07%；蒽醌类化合物为1，1-亚氨基二蒽醌，相对质量分数为0.11%；吲哚类化合物为吲哚，相对质量分数为0.06%；呋喃类化合物为2-戊基呋喃，相对质量分数为0.04%。

表1 春生田头菇菌盖挥发性成分分析表Table 1 GC-MS analytical results of chemical composition of volatile compositions of pileus from Agrocybe praecox

续表1

图2 春生田头菇子实体菌菌柄总离子流图谱Fig.2 Total ion current chromatogram of volatile compositions of the stipe of Agrocybe praecox

表2 春生田头菇菌柄挥发性成分分析表Table 2 GC-MS analytical results of chemical composition of volatile compositions of stipe from Agrocybe praecox

续表2

续表2

2.3 春生田头菇子实体菌盖和菌柄中挥发性化合物测定比较

图3 春生田头菇子实体菌盖挥发性化合物质量分数Fig.3 Proportion of volatile components substances in the pileus of Agrocybe praecox

图4 春生田头菇子实体菌柄挥发性化合物质量分数Fig.4 Proportion of volatile components substances in the stipe of Agrocybe praecox

春生田头菇子实体菌盖中检测出的挥发性化合物质量分数见图3，春生田头菇子实体菌柄中检测出的挥发性化合物质量分数见图4。菌盖和菌柄中两者均含有六甲基环三硅氧烷，十甲基环五硅氧烷，十二甲基环六硅氧烷，2-甲基-3-庚酮，丙位壬内酯，3-羟基扁桃酸乙酯，N-苯基-丙氨酸乙酯，苯甲醛，5-（1-哌啶）-糠醛，乙酸，苯乙酸，3-烯丙基-6-甲氧基酚，2-正戊基呋喃，（4-乙氧苯基）乙胺，4-乙基-1-甲基-2-吡唑啉和3，5-二羟基戊苯。

3 讨论

目前食品中风味物质的提取方法主要有水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法、超临界CO2萃取法、顶空收集法、同时蒸馏萃取法及固相微萃取法；而微生物挥发性代谢产物一般含量较低，主要检测方法有气相色谱法、质谱法、电子鼻法和高效液相色谱法等。由于提取时长、提取效率、检测灵敏度、样品数量和要求、重现性等问题，每种方法都有一定的缺陷性和限制性。固相微萃取技术是在固相萃取的基础上，集采样、萃取、浓缩、进样一体化，操作简单便捷，对环境污染小，符合全球绿色友好可持续发展理念，结合GC-MS技术被广泛运用在各个方面。

食用菌中的挥发性物质主要由八碳挥发性化合物、含硫化合物、醇类、酯类、酸类、醚类、酮类、醛类等化合物构成，风味物质主要由挥发性呈香物质和非挥发性呈味物质组成，各类化合物相互协调造就不同食用菌独特的香味和风味[21]。其中烯烃类化合物和酯类化合物是构成食用菌呈香的主要物质，烷类化合物虽不是构成食用菌呈香的主要物质，但是主要的辅助物质，醛类化合物具有特殊的香气，酮类化合物伴有花香和果香风味，醇类化合物在一定程度中对食用菌风味有贡献，大多数酚类化合物对食用菌的风味贡献不大，但有助于提升整体风味，呋喃、吡嗪等化合物也都具有特殊的气味。

殷朝敏[10]等对平菇、香菇、双孢蘑菇金针菇和杏鲍菇鲜品中关键挥发性风味成分进行测定，发现平菇鲜品中主体挥发性香气成分为1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇和3-辛酮；香菇鲜品中主体挥发性香气成分为二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、1-辛烯-3-酮和甲硫醇；双孢蘑菇和金针菇鲜品中主体挥发性香气成分为1-辛烯-3-酮、3-辛酮和3-辛醇；而杏鲍菇鲜品中的主体挥发性香气成分是1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇。李文[11]等对香菇中挥发性成分进行了研究，发现八碳化合物是构成香菇香气的主要物质之一，主要以1-辛烯-3-醇为主。Cho[22]等对松茸菌盖和菌柄的挥发性成分进行了比较研究，在菌盖和菌柄中分别检测出24种和21种挥发性成分，两者的主要挥发性成分分别为肉桂酸甲酯和1-辛烯-3-醇。Malheiro[23]等通过固相微萃取联合气质联用技术对6种不同的野生食用菌挥发性成分进行了研究，结果表明八碳化合物是这6种食用菌的主要挥发性成分，其中3-辛醇、1-辛醇和3-辛酮含量较高。殷朝敏[15]等对14种侧耳属食用菌干品挥发性香味成分进行了分析，发现不同食用菌干品挥发性成分的种类和含量差异很大，主要为1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇和正辛醛，此外，侧耳属食用菌中还存在一些重要的修饰性香气成分，如1-己醇、正己醛、2-丁基-2-辛烯醛、正辛醇、2-辛烯-1-醇、1-辛烯-3-酮和3-辛酮等，这些众多组分相互作用形成了侧耳属食用菌干品的独特香气。孙燕[14]对不同品种竹荪的挥发性成分及风味特性进行分析，发现不同温度竹荪品种所含挥发性成分不同，气味表现物质不同，其风味特征不同。温泉[24]等运用主成分分析研究不同培养料与草菇子实体挥发性成分的相关性，发现异戊醛、已醛、1-辛烯-3-醇、甲硫醇、2-戊基呋喃、二甲基硫醚为影响草菇子实体香气的特征性风味成分。李晔[12]等对灰树花中挥发性成分进行分析，发现酯类、烷烃类、醛类和萜烯类化合物为主要成分。李翔[17]等对人工和野生羊肚菌中的挥发性成分进行了比较研究，发现共有挥发性成分为3-甲基丁醛、戊醇、正己醛、3-甲基丁酸、甲酸己酯、庚醛、γ-戊内酯、1-辛烯-3-醇、正庚酸、反-2-辛烯醛，其中野生羊肚菌关键风味物质主要为3甲基丁醛、正己醛、庚醛、1-辛烯-3-醇、正庚酸、反-2-辛烯醛、壬醛；人工栽培羊肚菌关键风味物质主要为3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、正己醛、1-辛烯-3-醇。乐之歆[25]等对猴头菇的挥发性成分进行了研究，共鉴定出干猴头菇中的挥发性成分71种，其中醛类化合物的种类最多。陈智毅[26]对白金针菇的挥发性成分进行了分析，发现干金针菇的香气成分主要来源于其脂肪。冯涛[27]对松露挥发性风味成分进行了对比分析，发现1-辛烯-3-醇、对甲酚甲醚、3-甲基丁醛、二烯丙基二硫醚和二甲基硫醚在新鲜松露中的含量较高；对甲酚甲醚、己酸、右旋柠檬烯、二甲基砜、烯丙基甲基三硫醚在干制松露中含量较高。

采用顶空固相微萃取法结合气相色谱-质谱联用技术对春生田头菇子实体菌盖和菌柄的挥发性成分进行测定和分析，完善了春生田头菇挥发性成分的化学信息。本次研究共鉴定出79个化合物，菌盖鉴定出48种挥发性物质，分别占总挥发性物质60.76%；菌柄中共鉴定出47种挥发性物质，占总挥发性物质的59.45%。烷类化合物相对含量最高，其次为酮类化合物、酯类化合物、酸类化合物和醛类化合物，此外，还分析鉴定出春生田头菇还含有醇类、烯烃类，酰胺类，苯胺类、苯类，酚类，腈类、胺类，呋喃类，吡嗪类，嘧啶类、蒽醌类和其他类化合物。其中，烷类化合物主要以十二甲基环六硅氧烷和十甲基环五硅氧烷为主；酯类化合物主要为丙位壬内酯，浓时有椰子香味，稀释时有杏仁味或桃花香，以及亚油酸乙酯；酸类化合物主要为乙酸和苯乙酸，苯乙酸在低浓度时具有甜蜂蜜味；醇类化合物主要为2-乙基己醇，具有芳香气味；酮类化合物主要为2-甲基-3-庚酮，具有类似香柠檬和香叶的香气；2-甲基吡嗪具有焙烤香；糠醛具有焦糖香；2-戊基呋喃具有烘烤香味；吲哚具有花香气味；未检测出蘑菇特征挥发性物质1-辛烯-3-醇，原因可能是此特征物质在春生田头菇中含量极低，未达到检测限值。

4 结语

对春生田头菇子实体挥发性成分进行了分析鉴定研究，试验鉴定得到79个挥发性化合物，其中碳氢类化合物含量最多，明确了春生田头菇所含的特征性风味物质种类，其中起主要作用的挥发性物质为烷类、酯类、酮类和酸类化合物。对于相对含量较高的化合物之间的比例、阈值等是否是形成春生田头菇香味和风味物质的关键，还需进一步深入研究。本研究的结果可用于建立和完善食用菌香气数据库，为春生田头菇的综合利用提供参考依据。