抗菌肽APSH-07与抗生素对常见致病菌的体外协同抗菌效果研究

2021-09-04王海默钟世勋吕月琴刘兆胜孙汝江

饲料工业 2021年16期

■于航王海默钟世勋吕月琴刘兆胜孙汝江*

（1.中国农业大学烟台研究院，山东烟台 264670；2.山东深海生物科技股份有限公司，山东烟台 265500）

近年来，畜禽产品中抗生素的残留问题受到越来越多的重视，此外，由于抗生素使用不当，机体抵抗力也会下降，容易对细菌产生一定的耐药性。目前，饲料端抗生素类添加剂的使用已经全面禁止。如何通过在饲料中添加其他抗菌物质来提高畜禽的抗病能力，便成为研究的热点问题。抗菌肽是一种由生物体自身编码的多肽类物质，具有广谱抗菌活性，因其抗菌机理独特、无耐药性隐患且无残留，已成为抗生素的良好替代品，在实际的畜牧生产中具有广泛的应用前景[1]。关于抗菌肽的研究已有许多，例如，抗菌肽在提高动物免疫能力和疾病防御能力等方面具有促进作用[2-3]；抗菌肽可通过刺激黏液合成、促进紧密连接蛋白的产生和肠屏障的修复，影响肠上皮屏障完整性的维持[4]。一些报道表明，抗菌肽有与抗生素所不同的作用机制，相比于抗生素通过抑制细菌细胞壁的产生、蛋白质和DNA的合成等来达到抑菌的作用[5]，抗菌肽主要通过与细菌细胞膜作用来达到抑菌的目的，不易产生耐药性[6]；此外，抗菌肽还可通过调节适应性免疫反应或作为趋化因子招募其他效应细胞来发挥作用[7]。本试验测定了抗菌肽APSH-07对常见致病菌的抑菌活性，以及与常用抗生素体外联合使用的协同杀菌效应，并探究抗菌肽APSH-07成为新型饲料添加剂的潜力。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

大肠杆菌CICC21482、金黄色葡萄球菌ATCC6538P、哈维氏弧菌ATCCC BAA-1117、副溶血弧菌ATCC17802，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。试验菌株均保存于含20%甘油的冷冻管中，置于-80℃冰箱中。

1.1.2 主要试剂

阿莫西林（amoxicillin，纯度>98%），土霉素（oxy⁃tetracycline，纯度>98%），硫酸庆大霉素（gentamicin sulphate，纯度≥590 U/mg），硫酸新霉素（neomycin sul⁃fate，纯度99%），盐酸强力霉素（doxycycline hyclate，纯度>98%），均购自上海泰坦科技股份有限公司，保存于4℃冰箱中阴暗处；抗菌肽APSH-07，由山东深海生物科技股份有限公司提供，避光保存。

LB培养基粉末购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。LB培养基配方见表1。

表1 LB培养基配方

依据试验需要，配置两种培养基：

LB肉汤培养基：准确称量25 g LB粉末溶解于1 L蒸馏水，在高压蒸汽灭菌锅中121℃高压灭菌20 min后，保存于4℃冰箱待用；

LB琼脂培养基：准确称量25 g LB粉末和15 g琼脂粉末溶解于1 L蒸馏水中，在高压蒸汽灭菌锅中121℃高压灭菌20 min后，保存于4℃冰箱待用。

1.2 制备菌悬液

将冷冻保存的菌株常温下解冻，在LB琼脂平板上接种划线，于37℃恒温箱中过夜培养。菌落形成后，挑选平板上的单个菌落接种至50 mL新鲜LB肉汤培养基中，随后将肉汤置于37℃恒温摇床中，以170 r/min的速度震荡12～18 h直至菌液浑浊。经过稀释，在分光光度计下测得OD600=0.5左右，即可作为试验菌液。

1.3 药敏试验

1.3.1 最小抑菌浓度(MIC)的测定

将药品取出，配成一系列浓度梯度的溶液。用灭菌的LB肉汤将抗菌肽APSH-07配置成1 280μg/mL的储液，将抗生素配成320μg/mL的储液。之后继续用灭菌的LB肉汤将抗菌肽APSH-07的储液进行一系列双倍稀释，共得到1 280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μg/mL等10个浓度梯度的APSH-07稀释液；用灭菌LB肉汤将抗生素储液进行一系列双倍稀释，共得到320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL等10个浓度梯度的抗生素稀释液。

向无菌96孔板的1～10孔依次加入90μL菌悬液，并相应混合以10μL不同浓度的抗菌肽APSH-07或抗生素稀释液。在第11孔加入100μL的菌悬液作为阳性对照，在第12孔加入100μL的LB肉汤培养基作为阴性对照。注意每次混合液体时要用移液枪吹打均匀。

液体添加完毕后，将96孔板置于37℃的恒温培养箱中培养18～24 h，观察底部是否有细菌沉淀产生。无肉眼可见细菌沉淀的最小浓度即为该药物的最小抑菌浓度（MIC）。每种药物做3次重复。

1.3.2 最小杀菌浓度（MBC）的测定

取各药物MIC、2×MIC、4×MIC浓度的内容物各10μL，滴加至LB固态培养基上进行涂板，每个小孔做3次重复。待液体内容物被完全吸收后，将平板转移到37℃的恒温培养箱中，倒置，培养18～24 h，观察培养基上是否有菌落生长。无菌落生长的培养基对应的最小浓度即为该种药物的最小杀菌浓度（MBC）。

1.3.3 抗菌肽APSH-07与抗生素的联合药敏试验

以抗菌肽APSH-07和土霉素联用为例：分别配置2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5倍MIC浓度的抗菌肽APSH-07与土霉素溶液。进行6×6棋盘试验，土霉素以横行方式，APSH-07以纵列方式，将5μL各自不同浓度的药液加入96孔板中,每孔再加菌液90μL。由此，使得每一横行孔中土霉素的浓度依次为2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5倍的MIC，同时每一横行孔中APSH-07浓度不变；每一纵列孔中APSH-07的浓度依次为2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5倍的MIC，同时每一纵列孔中土霉素的浓度不变。混合均匀后，将96孔板转移到37℃的恒温培养箱中培养18～24 h。做3次重复。

在实验室中，以部分抑菌浓度指数(fractional in⁃hibitory concentration index,FIC Index)作为联合药敏试验效果的判断依据：

FIC Index=MIC A’/MIC A+MICB’/MICB

式中：MICA和MICB——A、B药物单独用药时的MIC值；

MICA’和MICB’——A、B两药联用时各自的MIC值。

根据FIC Index的范围可以判断联合药敏试验的效果：FIC Index≤0.5为协同效应；0.52为颉颃作用。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽APSH-07和抗生素单独使用的MIC与MBC值（见表2）

表2 抗菌肽APSH-07与抗生素对常见致病菌的MIC与MBC测定值

从表2中可看出，APSH-07对于四种菌的MIC与MBC均在4μg/mL以内，有较强的抑制作用。其中，APSH-07对于革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，对于其他三种革兰氏阴性菌抑制效果稍弱。五种抗生素对于除了副溶血弧菌的三种菌均有良好的抑制效果，其中盐酸强力霉素对大肠杆菌和哈维氏弧菌的抑制作用最明显；但对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑制效果稍弱一些。此外，在副溶血弧菌的试验中，五种抗生素均未检测到对其的抑制性。而操庆国等[8]通过试验证明了土霉素、新霉素等八种抗生素对副溶血弧菌的生长均产生抑制作用，这说明本试验的副溶血弧菌菌株可能对抗生素产生了耐药性，但产生耐药性的原因尚未可知。

2.2 抗菌肽APSH-07和抗生素联合药敏试验的结果（见表3～表7）

抗菌肽APSH-07分别与阿莫西林、土霉素、硫酸新霉素、硫酸庆大霉素、盐酸强力霉素联用，对金黄色葡萄球菌ATCC6538P、大肠杆菌CICC21482、哈维氏弧菌ATCCC BAA-1117的体外协同抗菌试验结果如表3～表7。

表3 抗菌肽APSH-07与阿莫西林单用和联用的作用效果

表4 抗菌肽APSH-07与土霉素单用和联用的作用效果

表5 抗菌肽APSH-07与硫酸新霉素单用和联用的作用效果

表7 抗菌肽APSH-07与盐酸强力霉素单用和联用的作用效果

表6 抗菌肽APSH-07与硫酸庆大霉素单用和联用的作用效果

根据试验结果可知，抗菌肽APSH-07与阿莫西林联用，对于哈维氏弧菌的抗菌效果最明显；与硫酸新霉素联用，对金黄色葡萄球菌ATCC6538P的抗菌效果最不好，但APSH-07与以上五种抗生素联用的FIC值均小于1，大部分小于0.5，均未有颉颃作用发生。此外，协同作用时，抗菌肽APSH-07的MIC值仅为其单独作用时的1/8～1/2，具有较为优良的作用。总的来看，APSH-07与阿莫西林联用时联合抗菌效果最好，表现为协同作用，FIC指数均小于或等于0.5，二者的相互促进作用更明显。

3 讨论

抗菌肽APSH-07是通过高效定向诱导植物乳杆菌表达的一种具有抗菌活性的小肽类物质，由于其三维结构中存在稳定的二硫键，故而性质稳定，对高温以及酸、碱、蛋白酶等具有良好的耐受性，可在动物体内正常发挥功能而不轻易失活。这种抗菌肽作为乳酸杆菌代谢过程产物，可以抑制脂多糖刺激产生的炎性因子mRNA的表达，同其发酵产物乳酸一起抑制LPS诱导的相关蛋白的活性，进而起到抑菌防腐、减轻肠道炎症、促进营养物质消化吸收等作用，但对肠道益生菌几乎无影响。Ge等[4]在日粮中添加APSH-07，显著提高了大黄鱼肝脏的SOD、CAT活性；Chen等[9]也发现，适量的APSH-07可增强皱纹盘鲍的抗氧化作用，并显著降低副溶血弧菌导致的死亡。

本试验将抗菌肽APSH-07与五种常用抗生素的抑菌活性进行对比，并将APSH-07与抗生素联用来测定协同抑菌效应，结果表明，APSH-07和抗生素对常见的致病菌均有抑菌效果，并且联合使用后效果比单独使用要好。这说明当抗菌肽和抗生素联合抑菌时，他们可能结合了各自的作用机理，从而使细菌更有效地被抑制或杀灭，同时，也阐明了抗菌肽代替抗生素的可行性。

在抗菌肽与抗生素联合使用方面，已有诸多研究。Wakabayashi等[10]的研究表明，抗菌肽LFcinB与二甲胺四环素联用可增强对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。华蕊等[11]通过试验发现，猪源抗菌肽PR-39与阿莫西林、土霉素、硫酸链霉素等联用，具有不同程度的协同作用。王国栋[12]也发现抗菌肽PG-1与丁胺卡那霉素、四环素联用对大肠杆菌的抑制有协同或相加作用。在畜禽疾病的治疗过程中，可将抗菌肽和抗生素混合使用，在更好地提高用药效果的同时，还可以预防并延迟抗生素耐药性的发生。因此，抗生素与抗菌肽的联用，可以作为畜牧生产中的一个发展方向。关于APSH-07具体的作用机制以及对动物可能产生的负面影响等问题，可在今后的试验中继续研究并予以完善。