浮萍中萍4701替代饲料对罗非鱼幼鱼生长和消化酶活性的影响

2021-09-04韩冰莹孙雪飘付莉莉谭德冠张家明

饲料工业 2021年16期

■陈婷韩冰莹孙雪飘付莉莉谭德冠张家明，3*

（1.南京农业大学生命科学学院，江苏南京 210059；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 571101；3.海南省热带生物质能源工程技术研究中心，海南海口 571101）

罗非鱼属丽鱼科罗非鱼属，原产于非洲，别名福寿鱼、非洲鲫鱼、南洋鲫等。其生长速度快，食性杂，抗病力强，适应性广，可在淡水或半咸水池塘及网箱中高密度集约化养殖。罗非鱼肉质鲜美嫩滑，刺少，烹饪方式多样，深受广大消费者的喜爱，被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一，是一种优良的水产品种[1]。根据美国亚利桑那大学Fitzsimmons教授测算，2020年全球罗非鱼产量为693万吨。虽然受新冠疫情和中美贸易战的影响，2020年，中国罗非鱼年总产量虽然比2019年有所下降（3%），但仍是罗非鱼第一生产大国，总产量达到170万吨，占世界罗非鱼总产量的24.5%[2]。根据2017年统计数据，中国罗非鱼产量占全国淡水养殖鱼类产量的5.45%[1]。在全国26个养殖罗非鱼的省（区）中，广东、海南、广西、云南、福建5省（区）由于气候适宜，是我国罗非鱼主产区，总产量占全国的90%[3]。

在罗非鱼养殖业快速发展的同时，罗非鱼饲料的需求量也不断增加，饲料蛋白源日趋紧张，饲料成本逐年提高。如何提高水产动物对各类蛋白源的利用率，降低养殖成本越来越引起人们的关注[4]。筛选成本更低、安全性更有保障的蛋白质替代品是重要的研究方向。

浮萍是常见的水生饲料植物，全球共有5属37种[5-6]。广泛分布于河流、湖泊和稻田，具有生长速度快、营养价值高的特点[7-8]。其蛋白质含量高，氨基酸组成平衡，是很有前景的植物蛋白源。目前已作为饲料蛋白源被广泛研究应用[9-10]。多年来，以色列和孟加拉国的农民种植浮萍作为鱼饲料，或将烘干的浮萍出口欧洲，据说产值是种水稻的10倍[11]。此外，浮萍还可利用养殖废水和市政废水作为肥料生长繁殖，在净化水质的同时积累生物质[12-14]，是潜力巨大的新型非粮生物质原料之一。

不过，野生浮萍的含水量高，通常为89%～91%，原生环境水体质量一般较差，可能含有细菌和寄生虫，因此，直接饲喂禽畜等动物有一定风险[4]，通常采用人工养殖的浮萍作为饲料原料。

本研究测试在罗非鱼基础饲料中添加不同比例的人工养殖的紫萍新品种中萍4701的干粉，研究其对罗非鱼生长性能和消化酶活性的影响，为浮萍成为新型蛋白质替代品提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

罗非鱼幼鱼购于海南省澄迈县瑞溪镇上琼村幼鱼养殖场。幼鱼平均体质量为（1.89±0.19）g/尾。养殖网箱规格为100 cm×100 cm×50 cm。浮萍干粉为本实验室的试验基地池塘大规模培育的海南本地筛选培育的高产、高蛋白浮萍品种中萍4701(Spirodela polyrhizaZP4701)。基础饲料为通威鱼用配合饲料1038，购自通威集团（中国成都）。

1.2 试验条件

试验所用3个池塘位于海南省海口市琼山区永朗村，为南北走向的长方形池塘。每个池塘为25 m×10 m。池底淤泥厚约30 cm，池深1.5 m。平时水深保持在60 cm，进排水使用潜水泵完成。2个池塘用于养殖浮萍，1个用于鱼饲料对比试验。

1.3 试验方法

1.3.1 浮萍的收集与处理

从池塘定期捞取浮萍，用带盖的塑料桶封装后运回实验室。自来水清洗后装入尼龙网袋，用甩干机甩干，然后置于烘干机中60℃烘干。使用粉碎机将其打磨成粉，过60目网筛，用塑封袋密封于低温干燥柜中保存。

1.3.2 饲料的配制

以通威鱼用配合饲料1038为对照饲料，经检测，该饲料含粗蛋白31.2%、粗脂肪8.35%、粗纤维4.2%、赖氨酸2%，是海南罗非鱼养殖企业常用的配方饲料。将饲料颗粒用粉碎机打成粉，分别添加不同比例[0（对照组）、10%、15%、20%、25%和30%]的浮萍干粉，混合均匀，用制粒机制成直径约3 mm的颗粒饲料。待饲料冷却后分装，于常温下避光保存备用。每次制料以7 d左右的投喂量为宜。

1.3.3 幼鱼投放

幼鱼投放前2 d，将池塘里的水抽出至深约30 cm，整齐安放网箱，确保固定养殖箱的竹竿足够牢固。每个网箱内投放大小均匀的罗非鱼幼鱼15尾。每种饲料喂3个网箱（3个重复），共18个网箱，其中以不添加浮萍的饲料为对照组。另外设置2个网箱养殖相同大小的候补幼鱼，用来补充在开食前的适应阶段死亡的幼鱼；开食后不再补充。

1.3.4 饲养管理

试验期间每天投喂相当于鱼体质量3%的配方饲料，分两次在上午9：00～10：00和下午17：00～18：00投喂。2～3 d换水1次，并不定时捕捞水面杂物，保持水面清洁。定期观察鱼的活动、摄食情况。若发现病鱼，及时采取相应的治疗措施。养殖期间，每20 d称重一次，根据罗非鱼体质量的变化，及时改变投喂量[15]。

1.3.5 生长指标的测定

幼鱼投放前测定并记录初始体质量。投放后停喂2 d，待罗非鱼适应池塘环境后开始喂食。饲养60 d后，停喂24 h，第2 d统计每个网箱内罗非鱼尾数并称总重。计算增重率、成活率。每个网箱随机取3尾接近平均体质量的罗非鱼，置于冰盒上，测量其体长、体质量，计算特定生长率。取其内脏及肝胰脏，用预冷的0.85%生理盐水冲洗，滤纸吸干表面水分，称重，计算肝体比、脏体比以及肥满度。增重率（WGR）、特定生长率（SGR）、肝体比（HSI）、脏体比（VSI）、肥满度（CF）和成活率（SR）通过下列公式计算[16]。

增重率（WGR，%）=（Wt-W0）/W0×100

特定生长率（SGR，%/d）=（lnWt-lnW0）/t×100

肥满度（CF，g/cm3）=Wt/L3×100

肝体比（HSI，%）=Wh/W×100

脏体比（VSI，%）=Wv/W×100

成活率（SR，%）=100×（试验末鱼尾数/试验初鱼尾数）

式中：Wt——鱼终末体质量(g)；

W0——鱼初始体质量(g)；

t——试验天数；

L——鱼体体长(cm)；W——鱼体质量(g)；

Wh——鱼体肝脏质量(g)；

Wv——鱼体内脏质量(g)。

1.3.6 消化酶活性的测定

消化器官样品的采集：将鱼体置于冰盒上解剖，分别取出胃、肠道、肝胰脏。剪除内脏表面附着的脂肪，用预冷的4℃蒸馏水冲洗掉黏附的血块以及内脏内容物，并用滤纸擦干。称重后剪碎（精确至0.01 g），在液氮中速冻后，放在-80℃的冰箱中保存备用。

酶液的制备：从-80℃的冰箱取出样品，放入玻璃匀浆器中，加入适量的4℃蒸馏水，在冰浴中匀浆。用相当于样品重量10倍的4℃蒸馏水将匀浆液冲洗至离心管中，分3次进行。然后在4℃条件下以6 000 r/min的转速将组织匀浆液离心15 min。取上清液分装，放在4℃冰箱中保存，在24 h内测定完毕。蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性的测定采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，按照使用说明书的步骤进行测定。

1.3.7 饲料指标测定

饲料在水中稳定性（溶失率）测定：称取试样10 g(准确至0.1 g)，放入自制的圆筒形网筛内，置于水深5.5 cm的容器中，水温为(25±2)℃。浸泡5 min后，把网筛从水中缓慢提至水面，又缓慢沉入水中，使饲料离开筛底，如此反复3次后取出网筛，沥干水分。把网筛连同饲料置于105℃烘箱内烘干至恒重，称重。同时，称一份未浸水的同样饲料，置于105℃烘箱内烘干至恒重，称重。

样品溶失率（%）=（样品溶失前烘干重-样品溶失后烘干重）/样品溶失前烘干重×100

样品含水量按照国家标准GB/T 6435—2014直接干燥法进行测定；水中稳定性按照标准SC/T 1077—2004中渔用配合饲料通用技术要求进行测定；灰分含量按照国家标准GB/T 6438—2007马弗炉灼烧法进行测定；粗纤维含量按照国家标准GB/T 6434—2006进行测定；粗脂肪含量按照国家标准GB/T 6433—2006进行测定；粗蛋白含量按照国家标准GB/T 6432—2018凯氏定氮法进行测定；氨基酸含量、微生物指标及重金属含量委托海南省检验检疫局的检测中心检测。其中氨基酸含量按照国标GB/T 18246—2000测定，霉菌总数按照国标GB/T 13092—2006检测，沙门氏菌按照国标GB/T 13091—2018检测。总砷含量按照国标GB/T 13079—2006检测，镉含量按照国标GB/T 13082—1991检测，汞含量按照国标GB/T 13081—2006第一法检测，铅含量按照国标GB/T 13080—2018检测。

采用Excel计算三次重复的平均值和SPSS Sta⁃tistics 17软件对试验数据进行t测验，试验数据以“平均值±标准误”表示。检验差异显著性，显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 饲料中添加浮萍对罗非鱼幼鱼生长的影响

幼鱼投入网箱后停喂2 d，个别网箱有1～2条罗非鱼死亡。推测是由于幼鱼运输或对环境不适应造成的。补充养在同一池塘候补的幼鱼。开食后没有再出现死亡现象，因此投喂饲料后，各处理的成活率均为100%。

饲料中添加不同比例的浮萍，对罗非鱼幼鱼的生长性能的影响（见表1）。由表1可知，在浮萍干粉添加比例为0～30%的范围内，随着添加比例的提高，罗非鱼终末体质量、增重率、特定生长率、肥满度、肝体比、脏体比等生长性能均呈先升高后下降的趋势。添加20%浮萍干粉的饲料组，罗非鱼幼鱼终末体质量、增重率、特定生长率、肥满度、脏体比、肝体比等指标都最高，分别比对照提高18.42%、19.61%、6.20%、20.37%、17.33%、395.00%，除脏体比外，均显著高于对照组(P<0.05)。进一步提高浮萍添加量，所有指标都比添加20%浮萍的试验组下降，其中终末体质量、增重率和特定生长率下降到与对照组相当的水平。但肥满度、肝体比和脏体比仍高于对照组。用添加浮萍的饲料养殖的罗非鱼幼鱼，其肝脏呈紫红色，与对照组肝脏没有区别。因此，添加浮萍后肝体比成倍增大不属于肝肿大的病理现象。鱼类不同生长时期肝体比会发生变化，养殖两个月的罗非鱼幼鱼正处于快速生长时期，肝脏发育较快[17]。因此，在饲料中添加浮萍，促进了肝脏的发育，这一点在后面的分析中还会提及。

表1 饲料中添加浮萍干粉对罗非鱼幼鱼生长性能的影响

2.2 饲料中浮萍干粉对罗非鱼幼鱼消化酶活性的影响

2.2.1 添加浮萍对罗非鱼淀粉酶活性的影响（见图1）

图1 不同浮萍添加水平对罗非鱼幼鱼消化道淀粉酶活性的影响

由图1所示，无论饲料中添加多大比例的浮萍，罗非鱼胃中淀粉酶活性均远高于其他器官，肝胰脏次之，肠中的淀粉酶活性最低，说明胃可能是罗非鱼消化淀粉的主要器官。浮萍添加比例对同一器官中淀粉酶活性有影响。随着添加水平的升高，胃、肠、肝胰脏等3个器官中淀粉酶活性均呈先上升后下降的趋势。其中，添加量为20%的饲料组，在胃、肠、肝胰脏中的淀粉酶活性都达最高值，分别比对照组高46.67%、81.81%、26.19%(P<0.05)。因此在饲料中适量添加浮萍干粉，可以促进罗非鱼消化道淀粉酶的分泌，提高饲料中淀粉的利用率。

2.2.2 添加浮萍对罗非鱼幼鱼蛋白酶活性的影响（见图2）

图2 不同浮萍添加水平对罗非鱼幼鱼消化道蛋白酶活性的影响

由图2可知，用对照饲料饲喂罗非鱼，胃中蛋白酶活性最高，肝胰脏次之，肠中最低。在饲料中添加10%的浮萍，显著提升肠道蛋白酶活性，而胃及肝胰脏蛋白酶活性没有显著变化，结果导致3种器官中蛋白酶活性基本持平。当浮萍添加比例达到20%时，胃、肠及肝胰脏中的蛋白酶活性都得到显著增加（P<0.05），分别比对照组提高35.91%、127.87%、27.73%。当浮萍添加量大于25%时，蛋白酶活性呈下降趋势。说明在饲料中添加适当比例的浮萍干粉，可以促进罗非鱼幼鱼蛋白酶的分泌，添加比例以20%最佳。

2.2.3 添加浮萍对罗非鱼幼鱼脂肪酶活性的影响（见图3）

图3 不同浮萍添加水平对罗非鱼幼鱼消化道脂肪酶活性的影响

由图3可知，用对照饲料喂养罗非鱼幼鱼，胃中脂肪酶活性远高于肠和肝胰脏。在饲料中添加10%～30%的浮萍干粉，对胃中脂肪酶活性没有显著影响，但显著提高了添加15%～25%浮萍干粉时肠及肝胰脏的脂肪酶活性。随着浮萍添加水平的升高，肝胰脏脂肪酶活性总体呈先上升后下降的趋势，当浮萍添加量为15%和20%时，肝胰脏脂肪酶活性分别比对照提高57.36%和64.64%（P<0.05)。当添加量为25%，肝胰脏脂肪酶活性达到最高，较对照提高97.33%（P<0.05)。这一结果从酶活性的角度说明食用浮萍饲料的罗非鱼肝胰脏脂肪酶活性高，表明肝胰脏中脂肪代谢率高[18]，说明前述研究所发现的肝体比增大不属于肝肿大或者脂肪肝等病理现象，也说明在饲料中添加浮萍，促进了肝脏的发育。肠道脂肪酶活性在浮萍不同添加水平间没有显著差异，但均显著高于对照，其中30%添加量时活性最高，比对照提高了238.22%（见图3）。

以上结果说明在饲料中添加浮萍干粉能显著提高罗非鱼幼鱼肠道及肝胰脏脂肪酶活性。

3 讨论

3.1 添加浮萍干粉饲料的营养价值、效用及安全性评价

木质素一般为植物细胞壁中仅次于纤维素的组成成分。然而，浮萍科植物由于其木质素合成相关代谢通路不活跃[19]，导致其细胞壁中木质素含量很低[20]，因此，浮萍作为饲料容易被动物消化。与此同时，由于木质素合成的弱化，木质素合成的起始物苯丙氨酸流向了黄酮和黄酮类合成途径[19]，导致浮萍富含黄酮类物质[21]。而黄酮类对鱼体的生长具有促进作用，尤其是异黄酮类，具有抗氧化和促进生长激素分泌的作用，因此能促进鱼类生长[22]。

浮萍20种氨基酸的组成与FAO所推荐的人类食物氨基酸最佳配比相似，具有促进摄食的作用，可以被动物高效利用[23]。尤其是浮萍含有高含量的赖氨酸和含硫氨基酸。赖氨酸和含硫氨基酸等是养殖动物的必需氨基酸[24]。

营养成分测定结果表明，对照组及添加20%ZP4701干粉的饲料各项营养指标均符合国家标准。添加20%ZP4701干粉的饲料中赖氨酸、含硫氨基酸、粗脂肪含量分别达到2.30%、1.10%和10.50%，比对照高12.7%、17.0%和26.5%（见表2）。但粗蛋白略低于对照饲料，为28.90%，比对照低7.4%，但仍高于国家标准（见表2）。ZP4701干粉的蛋白质含量为40%，高于通威配方饲料中的31.20%，添加20%ZP4701干粉到饲料中，理论上蛋白质含量应该高于对照。其实际检测结果低于对照的原因可能是饲料在再加工过程中，高温导致部分蛋白质损失。此类损失在前人研究中也有报道[25]。添加20%ZP4701干粉的饲料，其赖氨酸与含硫氨基酸的含量均略高于对照组饲料，这与ZP4701本身的氨基酸特性相符，其氨基酸含量均高于FAO（2010）推荐的氨基酸标准。另外，对照饲料的溶失率和水分偏高，可能与对照饲料保存时间更长有关。

表2 饲料稳定性及营养成分测定结果(%)

本研究发现，添加ZP4701干粉复合饲料保存一个月后，表观颜色与对照饲料一致，颗粒大小均匀，无发霉变质、结块、虫害现象，具有饲料正常气味，无霉味和酸败味。沙门氏菌、霉菌等是饲料中的主要微生物危害因素[26]。降低有害微生物指标是提高饲料质量与安全性的重要途径。微生物学指标检测结果表明，添加ZP4701的复合饲料中没有检出沙门氏菌，霉菌总数为240 CFU/g，比对照组高，但远低于国家标准（见表3）。因此，添加20%ZP4701干粉的复合饲料在微生物指标方面符合国家标准要求。

表3 饲料微生物学检测结果

砷、镉、铅和汞是影响动物健康的四类主要重金属元素[27]，动物及人类与其进行微量接触就可能产生明显的伤害，因此被称作“有毒贵金属”[28]。饲料中重金属超标会给人类以及环境带来严重危害，因此在饲料加工中必须十分重视这一问题。重金属含量测定结果表明，对照组及添加20%ZP4701的饲料中砷、镉、铅和汞均远低于国家标准（见表4）。说明饲料中添加20%的ZP4701对罗非鱼养殖是安全的，同时对环境亦不会造成重金属污染。

表4 重金属含量测定结果（mg/kg）

浮萍在鱼类饲料中的应用已有一些报道。张植元等[29]在饲料中添加0～14%浮萍干粉，研究对锦鲤生长发育的影响。当浮萍添加量为14%时，锦鲤特定生长率显著高于对照组。同时，与黑色素合成相关的限速酶——络氨酸酶TYR基因在锦鲤皮肤中的表达量也显著上调[30]。不过，两项报道所用的浮萍添加量都较低。埃及研究人员用5%～100%浮萍干粉替代鱼粉制备颗粒饲料饲喂罗非鱼。结果表明，替代率为20%时，罗非鱼的日增重、特定生长率、饲料转换率、蛋白质效率比值等参数与对照无差异，说明浮萍可替代20%的鱼粉[31]。Bairagi等[32]利用10%、20%、30%和40%的经过发酵和不发酵的浮萍干粉饲喂野鲮幼鱼，在不发酵的饲料组合中，10%添加量最好；在发酵的饲料组合中，30%的添加量最好。说明通过发酵，可以提高浮萍的添加量。

本研究结果表明，ZP4701干粉的添加量也不是越多越好。在10%～30%的添加水平内，随着添加水平的提高，罗非鱼生长性能总体呈现先上升后下降的趋势，添加水平达到20%时生长状况最佳。这一结果与黄斌等[33]的研究结果类似。他们在红色草金鱼的日粮中添加芜萍，发现添加量为20%时，草金鱼不仅生长速度快，而且蛋白质效率达到最高，饲料系数降到最低。当芜萍添加比例超过30%时，饲料蛋白质效率降低，饲料系数增高。Hassan等[34]的研究也表明，当浮萍的饲喂量不超过鱼体质量的4%时，罗非鱼可以更高效地利用浮萍。

3.2 浮萍对罗非鱼消化酶活性的影响

评价配合饲料营养价值的重要指标之一是饲料的表观消化率。鱼类摄食后，饲料成分作为消化酶的底物，影响消化酶的分泌和活力[35-38]。罗非鱼的消化酶主要有淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等[39]。胃、肠和肝胰脏黏膜是罗非鱼消化酶分泌的主要部位，有胃鱼类胃中的消化酶活性最高[40]。其中，淀粉酶能够水解糖原、淀粉和相关多糖糖苷键[41]。鱼类的脂肪酶主要由肝胰脏分泌，其活性随着鱼摄食食物脂肪含量的升高而增强[39]。脂肪在脂肪酶的作用下，分解成三酰甘油和自由脂肪酸的混合物而被鱼类吸收[42]。本研究添加20%ZP4701干粉的复合饲料中，粗脂肪含量比对照饲料提高了26.5%。这可能是罗非鱼肝胰脏和肠道脂肪酶活性显著提高的原因，其中肝胰脏和肠道脂肪酶活性分别比对照提高64.46%和238.22%（图3）。消化道脂肪酶活性的提高，促进了脂肪代谢[26]，从而加快罗非鱼的生长。

黄酮类物质被鱼体吸收后主要储藏在胃、肠和肝胰脏黏膜。由于黄酮类物质具有保护脏器并提升功能的作用。因此，饲料中黄酮类含量的提高也可能是罗非鱼消化酶活性提高的原因之一。这一推测得到其他研究的支持[22]。也有研究表明，转氨酶活性的增强有利于提高蛋白质代谢效率[43]，而浮萍中丰富的类胡萝卜素可以提高罗非鱼转氨酶的活性[44]，从而进一步增强消化酶的活性。