杨树溃疡病拮抗链霉菌的筛选及鉴定*

陈越渠 刘庆珍 李立梅张 杨韩 姣张永安

(1.中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 国家林业和草原局森林保护学重点实验室 北京 100091；2.吉林省林业科学研究院 长春 130033)

杨树溃疡病是我国杨树(Populusspp.)人工林的重要枝干病害，且发生面积越来越大，危害越来越严重。目前，关于杨树溃疡病的防治除选育抗病品种增强林木抗病能力外，主要采取化学防治。化学防治具有一定的防治效果，但是长期使用化学农药，不仅容易导致病原菌产生耐药性，而且也会造成环境污染(Hoyt,1969)。生防菌对病原菌有很强的抑制作用，具有专化性和持久性强的特点，且能够增强寄主植物的抗性(Zhouetal.,2014;McEvoy,2018)，因此，调查和筛选能有效抑制杨树溃疡病的生防菌，研制、开发环境友好型的生物杀菌剂开展生物防治，具有重要的现实意义。

链霉菌属(Streptomyces)是放线菌门(Actinobacteria)中最大最高等的一属，该属菌株能够产生几丁质酶、葡聚糖酶和纤维素酶等胞外水解酶裂解真菌细胞壁等多种具有生物活性的物质，使病原真菌生长受到阻碍，已被广泛应用于农林病害的生物防治(Baharloueietal.,2010;贺建武等,2011;Araetal.,2012;Tanetal.,2015)。研究发现，淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)的胞外代谢产物丰加霉素对黄瓜立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)的菌丝生长和菌核形成均有明显抑制作用(于冰等,2011)；长白山土壤中分离到的可可链霉菌(Streptomycescocaoi)182-2 产生的活性代谢产物KA08能够抑制麦角甾醇在细胞膜上的合成，引发细胞膜脂质过氧化，可使烟草赤星病菌链格孢(Alternariaalternata)的细胞膜受损、通透性增加，从而导致其菌丝生长受阻(高芬等,2013)。有些链霉菌还能分泌特有的物质促进植物生长，间接提高植物抗病性，如魏晓丽(2013)发现棉花(Gossypiumspp.)的内生拮抗淀粉酶链霉菌(S.diastaticussubsp.ardesiacus)在根内定殖可促进棉花幼苗光合及生长，其发酵液不同稀释浓度均能增强棉花胚根和胚轴生长；链霉菌JD211对水稻(Oryzasativa)具有较强的促生抗病效果，随菌剂浓度提高，幼苗内生菌含量下降，土壤病原微生物数量减少，可促使有益真菌、放线菌、原始动物、芽胞杆菌属(Bacillus)和链霉菌属等功能性菌群的生长；土壤有机质含量增加，矿质养分和酶活性提高，有助于改善土壤微生态环境，促进水稻植株生长(王世强,2014)。综上可知，链霉菌在植物病害的生物防治方面具有很广阔的发展和应用前景。

本研究以杨树溃疡病菌葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)为靶标，筛选能有效抑制杨树溃疡病且具有开发潜力的生防菌株，以期为杨树溃疡病的生物防治提供新的生防因子。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物病原菌：杨树溃疡病菌葡萄座腔菌、杨树烂皮病菌金黄壳囊孢菌(Cytosporachrysosperma)和云杉立枯病菌尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)，由吉林省林业科学研究院森林病理实验室分离纯化并保存；蓝莓溃疡病菌葡萄座腔菌和蓝莓枯枝病菌小新壳梭孢(Neofusicoccumparvum)，由延安大学徐成楠副教授馈赠；玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、水稻恶苗病菌串株镰刀菌(Fusariummoniliforme)、甜瓜枯萎病菌尖孢镰刀菌、大豆炭疽病菌(Colletotrichumtruncatum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、茄子褐纹病菌(Phomopsisvexans)、瓜果腐霉病菌(Pythiumaphanidermatum)和烟草赤星病菌链格孢由沈阳农业大学植物病毒研究室馈赠。

供试土样：采自吉林省长白山国家级自然保护区横山保护站落叶松林(Larixgmelinii)、池西保护站云杉林(Piceaasperata)、峰岭保护站针阔混交林等地，共计 18 份。

供试树苗：4 年生黄快杨(Populussimonii×P.pyramidalis‘Huangkuai’)扦插苗。

试剂：Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，上海生工生物工程股份有限公司；16S rDNA forward primer(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)reverse prime(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)；Taq PCR Master Mix(2×，blue dye)，上海生工生物工程股份有限公司；DNA Marker DL 2000，宝生物工程(大连)有限公司；Granulated agar，BD生物科学；其他均为国产分析纯。

仪器：BX53型奥林巴斯光学显微镜；ABI Veriti FAST 梯度PCR仪(美国ABI公司)；S-3400N型电子扫描显微镜(HITACHI公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 生防菌株筛选与抑菌活性测定 采用稀释分离法分离纯化菌株(周德庆,2011)。分离获得的所有菌株纯化 3～5 次后，转入高氏一号培养基培养，待各菌株产生足量孢子后进行抑菌活性测定。

以杨树溃疡病菌葡萄座腔菌为靶标，采用平板对峙培养法进行拮抗链霉菌抑菌活性测定。将靶标株菌制成直径 5 mm 菌饼接种于培养基正中央，在距离菌饼上下 17.5 mm处用接种环挑取培养 72 h 的放线菌在玻璃纸上划线接种，平行划线间距 35 mm，28 ℃ 恒温培养 72 h后测量放线菌与病原真菌之间抑菌带宽，每处理重复 3 次。根据抑菌带大小和稳定性获得目标菌株。

1.2.2 生防菌株及其发酵液抑菌谱测定 发酵培养基配方(质量体积比)：淀粉 7.0%、花生饼粉 3.3%、(NH4)2SO40.4%、CaCO30.4%、NaCl 0.4%，pH 7.0。种龄 5天，装样量 40 mL/250 mL，接菌量为 5 个直径 7 mm菌饼，恒温震荡培养(28 ℃、150 r·min-1)5天，发酵液 8 000 r·min-1离心 15 min，上清液过 45 μm细菌滤器，-20 ℃冰箱保存备用。

采用杯碟法测定发酵液抑菌谱，制备直径 5 mm的病原菌菌块，十字交叉等距倒置于PDA平板上，中央放置牛津杯，加样量 200 μL，28 ℃恒温培养箱中培养 72 h后，十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.2.3 菌株 HS1 发酵液对杨树溃疡病的防治效果 在吉林省林业有害生物天敌繁育基地杨树试验区，选取长势良好的 4 年生黄快杨进行人工接种防治试验。接种参照冀瑞卿(2007)方法，略有改进：用解剖刀在树干韧皮部划2 cm左右伤口，用酒精喷灯灼烧伤口约10 s后，将提前制备好的3个直径7 mm菌饼倒置于伤口处，浸无菌水的脱脂棉缠绕伤口，再用封口膜包扎，使脱脂棉保持温润状态。7天后解除包扎，停止保湿，去除菌饼，大部分树干开始发病，继续观察是否出现分生孢子器和分生孢子角。

生物测定试验采取接种前涂药处理和接种后涂药处理2种方式，每种处理方式分为发酵液上清液、稀释800倍液多菌灵和未发酵培养基上清液3组，每组 15 株，3 次重复。接种前涂药处理主要检测其预防作用，涂药 3 次，每次50 mL,间隔 72 h，涂药位置在接种处上下 20 cm范围内，最后1次涂药 72 h后接种；接种后涂药处理主要检测其治疗作用，接种 72 h后开始涂药，共 3 次，每次50 mL,间隔 72 h，涂药位置在接种处上下 20 cm范围内；对照组采用未发酵培养基上清液，处理方式同上。接种后15天调查苗木发病情况，计算防治效果，公式如下：

病情指数分级参考吉林省地方标准《杨树烂皮病综合治理技术规程》，Ⅰ级(代表值 0)：无病；Ⅱ级(代表值 1)：病斑横向长度占树干周长的 1/4 以下；Ⅲ级(代表值 2)：病斑横向长度占树干周长的 1/4～2/4 ；Ⅳ级(代表值 3)：病斑横向长度占树干周长的 2/4～3/4 ；Ⅴ级(代表值 4)：病斑横向长度占树干周长的 3/4 以上，树木濒死或死亡。

1.2.4 菌株 HS1 形态特征观察 将菌株培养液接种于高氏一号培养基，涂布涂匀，以灭菌盖玻片斜插于平板，28 ℃恒温培养5天后取出盖玻片置于光学显微镜下观察菌株形态特征。用扫描电镜观察菌株孢子链、孢子形态和表面结构，制片参照杨瑞等(2014)方法。按中国科学院微生物研究所放线菌分类组(1975)的研究方法，将菌株 HS1 转接于各鉴定培养基斜面，15天后观察并记录菌株在各鉴定培养基上气生菌丝、基内菌丝、可溶性色素的颜色和特征。

1.2.5 菌株 HS1 生理生化特性测定 菌株HS1耐受特性、碳源利用、酶学特性和代谢产物测定参照阮继生等(2011)方法。

1.2.6 菌株 HS1 分子生物学鉴定 DNA提取按Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书操作。PCR反应体系为 50 μL：PCR Mixture 25 μL，Template 2 μL，Primer F1、Primer R1 各 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 30 s，57 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 次循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。以无菌水的PCR产物为阴性对照，以实验室已测定 16S rDNA菌株的PCR产物为阳性对照，上样量2 μL，进行2%琼脂糖凝胶电泳。出现符合长度单一条带，将PCR产物送至长春库美生物公司测序，结果与EZbiocloud数据库比对，采用MEGA 6.0 软件的邻接法(neighbor-joining，NJ)进行序列比对并绘制系统发育树。

1.3 数据分析

采用 SPSS 19.0软件进行数据统计，Duncan新复极差法进行差异显著性分析，显著性水平 0.05。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛

通过调查、分离和纯化，得到104 株放线菌菌株，平板对峙培养结果发现，抑菌带宽大于10 mm的有 13 株，抑菌带宽大于 19 mm的有 3 株，其中，菌株HS1 抑菌效果最好，抑菌带宽达20.66 mm(表1、图1)。因此，选择菌株HS1 开展进一步研究。

表1 菌株对杨树溃疡病菌葡萄座腔菌的抑菌活性①Tab.1 Inhibition of strains streptomyces to Botryosphaeria dothidea

图1 菌株HS1对杨树溃疡病菌葡萄座腔菌的抑制效果Fig.1 The inhibition effect of strain HS1 to Botryosphaeria dothidea

2.2 菌株HS1 及其发酵液的抑菌谱

菌株HS1 抑菌谱广，对所有供试植物病原菌均有一定抑制作用(表 2)。对杨树溃疡病菌葡萄座腔菌、杨树烂皮病菌金黄壳囊孢菌、蓝莓溃疡病菌葡萄座腔菌、云杉立枯病菌尖孢镰刀菌、茄子褐纹病菌和大豆炭疽病菌的抑制作用明显，平均抑菌带宽达20.00 mm以上，与其他病原菌对比差异显著(P<0.05)；对玉米大斑病菌、烟草赤星病菌链格孢、甜瓜枯萎病菌尖孢镰刀菌、辣椒炭疽病菌也有较强的抑制作用，抑菌带宽达 15.00 mm以上。

菌株HS1 发酵液能够抑制所有供试植物病原菌生长(表 2)，对杨树溃疡病菌葡萄座腔菌、杨树烂皮病菌金黄壳囊孢菌、蓝莓溃疡病菌葡萄座腔菌和玉米大斑病菌的抑菌效果最好，与其他病原菌相比差异显著(P<0.05)，抑菌直径达39.00 mm以上；对大豆炭疽病菌、茄子褐纹病菌、烟草赤星病菌链格孢和辣椒炭疽病菌也具有良好的抑菌作用，抑菌直径超过 30.00 mm。

表2 菌株HS1及其发酵液的抑菌谱①Tab.2 Antimicrobial spectra of antagonistic microorganism and fermented broth about HS1

2.3 菌株HS1发酵液对杨树溃疡病的防治效果

对照组杨树发病率和病情指数显著高于处理组；菌株HS1发酵液对杨树溃疡病的治疗和预防效果均优于多菌灵，且差异显著(P<0.05)(表3)。继续观察 15天，对照组植株病斑扩大，可见明显的分生孢子器，部分有分生孢子角出现，而发酵液处理组植株病斑没有扩大，病斑处罕见分生孢子器，无分生孢子角出现。

表3 菌株HS1对杨树溃疡病的防治效果①Tab.3 Inhibition effect of the strain HS1 against poplar canker

2.4 菌株HS1 的分类鉴定

2.4.1 菌株HS1的形态特征 菌株HS1 在高氏一号培养基上呈辐射状生长，气生菌丝茂盛，28 ℃ 培养 1～2天，圆形菌落光滑、无孢子生成。第 3天开始有白色孢子从菌落边缘长出，4天后逐渐变为肉蚌白色，基质菌丝体呈酪黄色，无可溶性色素产生(图2A)。培养 30天后，菌落凸出变大，呈灰紫粉色(图2B)。光学显微镜下观察发现，菌丝细长且有大量分枝，菌丝多呈直线形，无横膜，不断裂(图2C)，孢子可见于菌丝不同位点(图2D)。扫描电镜下观察发现，菌丝饱满，表面光滑，呈直线形，有的末端略有弯曲，孢子呈圆柱形，大小均一，孢子链延伸呈直线形(图3)。根据形态特征，初步判定菌株HS1 为链霉菌。

图2 菌株HS1的菌落(A、B)、菌丝(C)和孢子(D)Fig.2 The morphology of colony(A,B),hyphae(C)and spores(D)of the strain HS1

图3 菌株HS1的菌丝和孢子电镜图像Fig.3 The hyphae and spores of the strain HS1

2.4.2 菌株HS1的培养特征 菌株HS1转接于15种鉴定培养基上，28 ℃恒温培养24～48 h后有菌落出现，72～96 h后开始产生孢子。不同培养基上菌苔形态、孢子堆颜色、基质菌丝颜色、产生色素和生长情况有所不同。菌株HS1在不同培养基上菌丝大部分近白色，基内多呈黄色和白色，只在个别培养基中产生可溶性色素(表4)。综合菌株在15种鉴定培养基上的培养特征及菌丝和孢子形态，初步判定菌株HS1为淡紫灰类群链霉菌。

表4 菌株HS1的培养特征①Tab.4 Cultural characteristic of the strain HS1

2.5 菌株HS1的生理生化特征

菌株HS1在pH 5～12范围内均可生长，pH=7 时生长最旺盛；菌株HS1对NaCl有较强的耐受性，盐浓度30%时丰茂度最好；菌株HS1在4～28 ℃范围内均可生长，但不耐受高温，对低温有较好的耐受性，28 ℃左右最适宜生长(表5)。

表5 菌株HS1的耐受性Tab.5 Tolerance to pH/temperature/NaCl of the strain HS1

菌株HS1能够利用D-木糖、D-果糖、葡萄糖、α-乳糖、麦芽糖、鸟嘌呤、甘氨酸、L-酪氨酸和L-阿拉伯糖，其中以D-木糖、D-果糖和葡萄糖为碳源时生长旺盛，但菌株HS1不能利用棉子糖、甘露醇和L-鼠李糖(表6)。菌株HS1过氧化氢酶、脲酶、淀粉水解试验均为阳性，酯酶试验为阴性，不能使明胶液化，不能分解利用纤维素。甲基红(M-R)试验、乙酰甲基甲醇(V-P)试验、H2S产生试验和硝酸盐还原试验均为阳性(图4)。

图4 菌株HS1硝酸盐还原试验/甲基红试验/乙酰甲基甲醇试验Fig.4 Nitrate reduction/M-R/V-P test of the strain HS1

表6 菌株HS1的碳源利用Tab.6 Utilization of carbon sources of the strain HS1

2.6 菌株HS1的分子生物学鉴定

提取菌株HS1基因组DNA并进行PCR扩增和测序(图5)，得到菌株16S rDNA基因扩增片段长度为1 398 bp(基因登录号：MN636764)。与EZbiocloud数据库链霉菌16S rDNA序列比对并构建系统发育树(图6)，结果发现，菌株HS1与Streptomycesscopuliridis同源性最高，达99%。

图5 HS1基因组DNA和16S rDNA 扩增产物电泳结果Fig.5 Electrophoresis of the genome DNA of the strain HS1 and the genome of 16S rDNA by PCR productsM:DNA Marker DL15000+2000;1:HS1的总DNA;2、5:阳性对照;3、4:HS1 DNA16S rDNA PCR产物;6:阴性对照.M:DNA Marker DL15000+2000;1:Total DNA of HS1;2,5:Positive control;3,4:PCR products of HS1 DNA16S rDNA;6:Negative control.

图6 菌株HS1及相关菌株的系统发育分析Fig.6 The phylogenetic tree of the strain HS1 and relative strains

3 讨论

杨树溃疡病菌葡萄座腔菌寄主广泛，不仅危害杨树，而且还可引起苹果轮纹病(孙鑫垚,2010)、蓝莓枝干溃疡病(康海婷等,2019)、甜樱桃流胶病(张倩等,2020)、山核桃干腐病(王琼伟，2019)等多种病害，给农林业生产造成重大经济损失。目前，已有一些关于杨树溃疡病生防菌株的报道，如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(胥丽娜等,2007)、黄绿木霉菌(Trichodermaaureoviride)和木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)(杨蕾等，2015)等，以及葡萄座腔菌引起的苹果轮纹病生防菌株筛选的报道，如娄彻氏链霉菌(Streptomycesrochei)(李永丽等,2020)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)(陈欣怡,2016)等，但还均处于室内体外抗菌活性测定试验阶段，仍需筛选出更多优质的生防菌株，系统开展发酵工艺、抗菌机制、抗菌物质鉴定等方面的深入研究，以开发出环保高效的生物菌剂应用于生产。

Farris等(2011)在美国阿拉巴马州土壤中分离出链霉菌StreptomycesscopuliridisRB72T，其理化性质和形态与菌株HS1有一定相似性。刘若寒(2015)从链霉菌Streptomycesscopuliridis发酵液中分离鉴定出9种次级代谢产物，其中包括2种新化合物。Li等(2016)也从土壤中分离到Streptomycesscopuliridis，并从发酵液中分离出2种新型倍半萜。目前，未见链霉菌Streptomycesscopuliridis应用于植物病害防治的研究。

本研究通过形态观察、菌株理化特性测定、16S rDNA序列分析等方法对生防菌株HS1的分类地位进行探讨，但16S rDNA序列比对分析结果发现，菌株HS1与Streptomycesscopuliridis并非100%同源，目前正在开展全基因组测序，以期通过更深入的研究明确菌株HS1的分类地位。另外，林间防治试验结果表明，菌株HS1发酵液对杨树溃疡病具有良好的防治和治疗效果，推测其代谢产物可能对杨树防御酶体系启动有诱导作用，需开展菌株对杨树诱导抗病性机制方面的研究加以证实。本研究仅对菌株HS1的分离鉴定和林间防治效果进行了探讨，进一步开发菌株为生防制剂或生物肥料应用于生产实际需对其抑菌机制、代谢产物中活性物质分离纯化、在植物根际定殖能力以及安全性评价等方面开展深入研究。

4 结论

采用稀释分离法从吉林省长白山国家级自然保护区横山保护站林下土壤样品中分离得到104株放线菌菌株，以杨树溃疡病菌葡萄座腔菌为靶标，运用多重筛选法获得了抑菌效果明显、抑菌谱广且效果稳定的生防链霉菌菌株HS1，通过形态学和生理生化特征分析，初步鉴定该菌株为淡紫灰类群链霉菌；16S rDNA序列比对分析结果发现，菌株HS1与Streptomycesscopuliridi同源性最高。人工接种试验结果显示，菌株HS1发酵液对杨树溃疡病的预防和治疗效果分别为60.87%和71.74%。生防菌株HS1可有效预防和控制杨树溃疡病，且对多种农林重要病害病原菌的抑菌作用效果明显，具有广阔的开发利用前景。