BD FACSAria Ⅲ流式细胞分选仪的常见故障分析

任晓越，李敬贤，熊缨

上海科技大学 生命科学与技术学院，上海 201210

引言

流式细胞分选仪可将具有特定标志物或功能的细胞从混合细胞群中分离出来，再进行细胞培养、蛋白检测、基因编辑、基因组测序等应用[1-4]。随着细胞治疗和精准医疗的快速发展，流式细胞分选技术将在临床研究与治疗中得到更广泛的应用[5]。

市场上主流的分选型流式细胞仪有BD公司的FACSAria Ⅲ、Beckman公司的MoFlo XDP、Sony公司的SH800，将各个仪器的特征进行分析对比[6]，详见表1。其中，BD FACSAria Ⅲ的荧光灵敏度最高，意味着最佳的样本分辨率。

表1 市场上不同品牌流式细胞分选仪的分析对比

作为市场占有率最高的分选仪之一[7]，BD FACSAriaⅢ可用于进行干细胞、肿瘤细胞、生殖细胞等各类细胞的分选，细胞可以收集到收集管和不同孔径的孔板中进行后续分析或培养[8]。在仪器使用过程中，会出现侧液流分散、无法分选、喷嘴堵塞等各类故障情况，导致分选无法进行。目前，比较热门的是对流式细胞术实验方法的开发和优化，而对于仪器在使用中出现的故障情况研究案例较少，且并未探讨故障背后的原因。所以，在多年BD FACSAria III使用经验的基础上，本文通过BD FACSAria Ⅲ原理简介及一些维修案例的分享，总结探讨维修经验和方法，以期为同行提供参考。

1 设备原理

流式细胞仪是集现代物理电子技术、激光技术、计算机技术于一体的先进科学技术设备，能够对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析[9]。流式细胞分选仪在流式细胞分析仪的基础上增加了分选系统，细胞分选仪BD FACSAria Ⅲ由三个主要部分构成，分别是液流车、流式细胞仪主机和工作站（BD FACSDiva软件）。液流车能够向主机供应鞘液、清洗液，并从主机里回收废液；流式细胞仪主机包括液流组件、光学组件、电子组件[10]；工作站可以控制进样和流速，并通过摄像头实时监测细胞分选情况。

在一定压力下，样本被进样针吸取进入石英杯样品池，鞘液经由另一管线进入，在压力驱动下包裹着排成单列的细胞经过喷嘴后加速到达检测点，激光照射到细胞上发生散射和折射，发出散射光，同时，细胞携带的荧光素被激光照射发出荧光。检测器把散射光信号转换成电信号，荧光则被聚光器收集，经各个光纤传导进入八角转盘或三角转盘检测器，被不同滤光片组件拆分后，由对应的光电倍增管检测器接收并将荧光信号转换成电信号。最后经过数据化的处理，输入电脑储存分析[11]。被鞘液包裹的样本流经过喷嘴后，被振荡器振荡成为均匀的液滴，包含有目标细胞的液滴会被充以电荷，在电场的作用下偏转进入收集器中，其余液滴则会进入废液槽中。流式细胞分选原理如图1所示。

图1 流式细胞分选原理图

2 常见故障的解决方法

2.1 故障一

2.1.1 故障现象

BD FACSAria Ⅲ不能正常进样，进样速度一直显示为0，或流速固定为1.0时，进样速度不能稳定，变化较大。正常状态是：以100 µm喷嘴为例，流速为1.0时，1.5 mL无菌水加1滴时间延迟校准微球的正常进样速度为1000 evt/s。

2.1.2 故障分析

如果仪器无法正常进样，通常是由于进样针被堵塞。需要分为两种情况进行分析：① 样品未混匀或未过筛网，有聚集的细胞团块堵塞了进样针；② 样品分选过程中逐渐发生堵塞。另外，还有一种可能即上样仓没有卡紧，导致上样压力不正常，从而无法正常进样。

2.1.3 故障解决

根据以上的3种情况，采用不同的方法进行判断，从而排除故障：① 上样时间延迟校准微球，观察上样颗粒数的情况。如果进样速度正常，就将样品卸载下来，用细胞筛网过滤样品后再上样；② 仔细观察进样速度的变化，当数值快速降低时，就是进样针快被堵塞，此时应该将样品卸载下来，多次反冲进样针；如果堵塞严重，把管夹阀里嵌着的白色软管取出，快速反冲进样针。如果还是无效，就必须更换主要进样管线和相连白色软管（图2）；③ 通过上样后能否听到咔哒声这一方法判断上样仓是否卡紧，解决方法是在样品架上边沿位置涂抹润滑油，以起到密封的效果。

图2 BD FACSAria III的进样管线

2.2 故障二

2.2.1 故障现象

液流不稳定，断点位置不稳定，会上下跳动，且Gap值变化很大。正常状态：正常开机以后，不同规格喷嘴的液流状态如图3所示。

图3 BD FACSAria III的三种喷嘴所对应最佳液流断点图

2.2.2 故障分析

由于鞘液包裹的样本经过激光器被检测之后，才会被振荡成为单个液滴，液流的稳定性决定了从检测点到加电分选位置的时间差变化[12]。那么对于判断是否能够分选到正确的目的细胞，液流稳定性在整个细胞分选的过程就至关重要。

如果液流中有开机清洗后残余的乙醇或者气体，那么在液流经过喷嘴被高频振荡形成单个液滴过程中，液滴表面张力会发生变化，从而影响液滴形成过程，破坏断点位置的稳定性。另外一种可能是当喷嘴被堵塞或是样品池中有碎片时，会阻碍鞘液的液体流动，导致液体的流动性受到影响，进而导致液流不稳定。

2.2.3 故障解决

通常情况下，延长无菌水的清洗管路时间，或者选择菜单栏cytometer下面的液流启动用鞘液充满管路来排除气体和乙醇，是非常有效方法。如果发现鞘液过滤器中有气泡，可以拧松鞘液过滤器上的阀门，手动排除过滤器中的气体。

根据实验过程中的样品情况分析，如果分选样本未及时过滤或是死细胞较多时，那么就会使喷嘴被堵塞或样品池中有碎片。此时，应立刻关闭液流，拿走喷嘴，超声喷嘴1 min，如果仍然无效，可以点开stream，用鞘液冲洗样品池约10 s。

2.3 故障三

2.3.1 故障现象

分选过程中，侧液流不集中，较分散（图4）。

图4 不同分选状态的侧液流图

2.3.2 故障分析

在判断仪器故障状态之前，首先要确认样本情况，当样品细胞太大的时候，细胞在液滴中的比重偏大，说明所用喷嘴对于样品细胞的规格是不合适的，此时应该更换一个更大规格的喷嘴。

排除样本因素之后，通常情况，需要考虑的是电场中的加电情况，这需要分为两种情况进行分析：① 分选仓的电极板上溅了鞘液，影响电场的导电；② 液流图像窗口的2nd、3rd、4th Drop values不是最优值，影响了中心液流的聚电效应。

除此之外，在观察液流图像时进行分析，如果喷嘴有轻微堵塞或者Ampl值不是最优值，也可能造成侧液流分散。

2.3.3 解决方案

根据上述分析，首先应打开分选仓检查电极板上是否有液体，若有，则应关闭液流，用无尘纸擦干净分选仓内电极板上的液体；其次调节液流图像窗口的2nd、3rd、4th Drop values这三个值，加强聚电效应，集中侧液流。在排除上述两种情况后，可以通过超声喷嘴，或者重新调整优化Ampl值来解决这一故障问题。

3 讨论

目前，大多数研究均聚焦于细胞分选仪实验方法的开发和优化，忽略了对仪器故障和维修情况的整理和研究。基于多年来在仪器操作过程中的常见故障现象，本文结合流式细胞术分选原理，详细列举了各种情况下故障案例的成因，并结合分析各种解决方案的有效性，以便其他使用者在碰到相同故障时可以对可能的原因进行优先排除，能更快更准的解决问题。

本文中分析的三个故障案例都是常见情况，甚至液流不稳定这种现象，仪器使用的新手可能都不会注意到。但是液流的稳定性和侧液流状态对分选结果的好坏至关重要，即能否分选到正确的细胞。分选仪在临床上虽不用做诊断设备，但是可能会用于细胞治疗中的靶细胞分离纯化、或者分离临床样本用于后续机理研究，如果得不到足够纯的目的细胞，细胞治疗的效果可想而知，后续机理研究的准确性也值得商榷。所以，在实际仪器操作中，一旦出现故障，要及时排除，确保珍贵的临床样本不被浪费，并避免后续更大的损失与浪费。

另外，需要注意的是在仪器操作中个人防护也应引起重视，特别是用于临床样本分选的仪器。作为电荷式分选仪，BD FACSAria Ⅲ能够将鞘液包裹的样本液流振荡成为单个的液滴，任何一个气溶胶液滴均可能包含导致感染的某种细胞。因此，仪器操作者应该做好个人防护，穿戴好实验服、口罩和手套，来防止可能会有的生物安全风险[13-14]。

在保障仪器正常稳定运行的基础上，后续本团队将对影响分离细胞活性的相关因素包括样品前处理、仪器参数设置、收集状态等，以及个人防护方面进行深入探索。

4 结论

往往一个很小的问题，会导致大的故障，因此，做好仪器的日常维护与保养非常重要。本文就3例故障案例进行了讨论分析，其中故障二即液流不稳定，是所有流式细胞分选仪常见故障类型[15]，所以解决方案可供其他品牌仪器参考借鉴。由于分选样本的制备过程复杂，所用的抗体试剂也较为昂贵，所以在细胞分选过程中，使用者如果发现上述故障现象，应立刻停止分选，并按照本文提供的解决方案进行排查。

BD FACSAria Ⅲ这款仪器能够满足快速分选要求，使用率高，但是售价高昂，零配件价格也高，所以仪器的日常维护和管理非常重要。只有保障仪器的运行稳定，才能更加有效和准确地进行分选实验，也能提高仪器的使用寿命[16]。本文通过对BD FACSAria Ⅲ的工作原理的介绍，以及对仪器使用过程中的常见故障原因及解决方法的详细分析，希望为仪器的正确使用及故障的快速排除提供参考，使仪器能高效稳定地运行。