枯草芽孢杆菌发酵麦糟制备蛋白肽培养基研究

肖连冬，李慧星，于海彦，罗建成，程 爽

（1.南阳理工学院 生物与化学工程学院，河南 南阳 473000；2.河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南 南阳 473000）

麦糟是啤酒生产的主要副产物，含有丰富的非淀粉多糖和蛋白质[1-5]，其中麦糟中的蛋白质含量因大麦品种、麦芽制备及啤酒生产工艺等诸多因素的影响而不同，一般在12%～30%不等[6-7]，因此麦糟是一种良好的蛋白质资源，适合作为开发食品与保健品的原材料。我国是啤酒生产大国，2019年中国啤酒产量3.765×107kL[8]，以每千升啤酒产0.03 t干糟计，中国每年可产生约112.95万t啤酒糟[9]，如此数量的宝贵资源，如充分加以开发利用，可以缓解我国蛋白质资源不足的问题。

麦糟蛋白肽是降解麦糟中蛋白质制得低分子质量、高活性的肽类[10]，其不仅具有优良加工特性如溶解性、乳化性、起泡性、持水性等[11-12]，还具有抗疲劳、抗氧化、降血压、降血糖、抗胆固醇和提高机体免疫力等生理活性[13-16]。科学研究证明，人体内蛋白质消化后大都以小肽的形式吸收，比氨基酸更容易被人体吸收利用，具有更高的生物活性和营养价值[17]。因而，蛋白肽产品的生产已经成为目前国际研究的热门课题之一。目前，国内外关于麦糟制备蛋白肽的研究尚不广泛，多以酶法制备，水解程度低，成本比较高，采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵麦糟制备蛋白肽未见报道。

本试验利用枯草芽孢杆菌固态发酵技术，通过生物转化生产麦糟蛋白肽，以麦糟作为氮源探讨发酵制备麦糟蛋白肽培养基条件。着重考察麦糟发酵培养基碳源种类、碳源添加量、培养基料液比、拌料水pH值及磷酸二氢钾添加量对麦糟发酵生产蛋白肽的影响，优化培养基条件，以期为工业化生产麦糟活性肽提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室提供。

1.1.2 材料与试剂

麦糟：南阳市京德啤酒技术开发有限公司（干燥，粉碎过80目筛，粗蛋白含量18.35%）；耐高温组培封口膜：常德比克曼生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、氯化钠（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；酒石酸钾钠（分析纯）：天津市德恩化学试剂有限公司；硫酸铜、三氯乙酸、氢氧化钠（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；碘化钾（纯度＞99%）、牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉（均为生物试剂）：天津市永晟精细化工有限公司；牛血清白蛋白（色谱纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司；磷酸二氢钾（分析纯）：北京精求化工厂。

1.1.3 培养基

种子培养基：牛肉膏3 g/L，氯化钠5.0 g/L，蛋白胨10 g/L，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基：麦糟、碳源（淀粉/蔗糖/葡萄糖）、磷酸二氢钾、水按一定比例配制。

1.2 仪器与设备

LDZW型立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2G型双人净化工作台：苏州净化设备有限公司；SPX-300-Ⅲ型生化培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；MQD-A3型高精度三层叠加式振荡培养箱：上海旻泉仪器有限公司；UV1600-759型紫外可见光分光光度计：上海菁化科技器材有限公司；TDL·40C型低速台式大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；PHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；BSA124S型分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 种子液制备

取1支活化菌种斜面，加入10 mL种子培养基，用接种环将斜面菌苔全部剥离洗下，摇匀；吸取2 mL接至已灭菌的20 mL种子培养基中，于36 ℃恒温摇床120 r/min条件下培养8 h，获得种子液。

1.3.2 麦糟蛋白肽发酵试验

称取麦糟样品5.0 g置于250 mL三角瓶中，封口膜封口，包扎，121 ℃灭菌20 min；另取1支试管，根据麦糟与水的比加入所需的水量，然后加入一定比例的碳源及磷酸二氢钾，溶解，调pH值，121 ℃灭菌20 min；待试管中溶液冷却至室温后，接入2 mL种子液，摇匀，制备成含菌拌料水，加入已灭菌的固体麦糟中，搅匀，置于恒温培养箱中，37 ℃培养84 h。

1.3.3 发酵麦糟蛋白肽的萃取和测定

蛋白肽萃取：取100 mL蒸馏水加入发酵后的固态基质中，于磁力搅拌器上搅拌30 min，4 000 r/min离心10 min，收集上清液并定容至100 mL。取上清液5 mL，加入5 mL 10%三氯乙酸，摇匀后常温静置30 min，4 000 r/min离心15 min，得上清液备用。

蛋白肽测定：采用双缩脲法[18]。取上清液1 mL，加入4 mL双缩脲试剂，摇匀后常温静置30 min，测OD540nm值，根据蛋白肽测定回归方程，得出蛋白质浓度，计算出总蛋白质量，按公式（1）计算肽得率：

1.3.4 麦糟蛋白肽发酵培养基优化单因素试验

以肽得率为考察指标，在其他条件相同时，分别考察不同碳源（淀粉、蔗糖、葡萄糖）、碳源添加量（3%、4%、5%、6%、7%）、料液比（1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3（g∶mL））、磷酸二氢钾添加量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）和拌料水pH值（5、6、7、8、9）对发酵结果的影响。每个试验重复3次，结果取平均值。

1.3.5 麦糟蛋白肽发酵培养基优化响应面试验

在单因素试验的基础上，设计Box-Behnken试验方案[19-20]进一步研究葡萄糖添加量（A）、料液比（B）、磷酸二氢钾添加量（C）对肽得率的影响，考察因素的交互作用及显著性，优化培养基配方。响应面试验因素水平及编码见表1。

表1 培养基优化响应面试验因素与水平Table1 Factors and levels of response surface experiments for medium optimization

2 结果与分析

2.1 蛋白肽测定回归方程拟合

取不同体积的牛血清蛋白标准溶液，按照样品测定方法显色，于波长540 nm下测定吸光度值，以蛋白质含量（x）为自变量，以吸光度值（y）为因变量，建立标准曲线，得到回归方程y=0.041x+0.001（R2=0.999）。

2.2 麦糟蛋白肽发酵培养基优化单因素试验

2.2.1 碳源种类对肽得率的影响

碳源添加量5%，磷酸二氢钾添加量0.5%，料液比1.0∶2.5（g∶mL），拌料水pH=7时，不同碳源对肽得率的影响见图1。

图1 碳源种类对肽得率的影响Fig.1 Effect of carbon sources on peptide yield

碳源为微生物生长提供碳架和能源，而麦糟中残留总糖很低[21]，需要外加碳源来补充培养基中碳源不足，保证枯草芽孢杆菌正常生长代谢。由图1可见，碳源种类对枯草芽孢杆菌发酵生产蛋白肽有明显影响。三种碳源淀粉、蔗糖、葡萄糖中以葡萄糖作为碳源发酵效果最好，肽得率最高，蔗糖次之，淀粉因为较难利用对结果影响较小。通过对试验数据的方差分析表明，葡萄糖对肽得率的影响显著，因此，试验确定在枯草芽孢杆菌发酵培养基中添加葡萄糖作为碳源。

2.2.2 葡萄糖添加量对肽得率的影响

当磷酸二氢钾添加0.5%，料液比1.0∶2.5（g∶mL），拌料水pH=7时，葡萄糖添加量对肽得率的影响见图2。

图2 不同葡萄糖添加量对肽得率的影响Fig.2 Effect of different glucose addition on peptide yield

葡萄糖是微生物生长繁殖很重要的营养物质，在蛋白肽的发酵生产过程中，需要大量的碳源来维持其微生物细胞生长繁殖和产酶。由图2可知，葡萄糖添加量对麦糟多肽发酵生产影响较大。当葡萄糖浓度较低时，肽得率随葡萄糖添加量的增加而提高，当葡萄糖添加量为4%时，肽得率达到最高，随着葡萄糖添加量的继续增加肽得率逐渐下降。原因是过多的葡萄糖会加速菌体的呼吸作用，导致因溶氧不足而影响菌体的生长和产酶[22]；如果葡萄糖含量继续增加超过限定后会因为高渗透压造成细胞失水，抑制微生物的生长发酵，肽得率下降。试验得出较佳葡萄糖添加量为4%。

2.2.3 料液比对肽得率的影响

在葡萄糖添加量5%，磷酸二氢钾添加量0.5%，拌料水pH=7条件下，麦糟与水的料液比对肽得率的影响见图3。

水是微生物与营养物质接触的桥梁，培养基含水量的高低对微生物的生长及代谢有重要影响。对固态发酵而言，含水量低会影响物料基质的吸水膨胀，从而影响微生物对基质接触代谢，含水量过高又会影响培养基内溶氧和CO2的排出，微生物难以生长和产酶。由图3可知，随着加水量的增加，肽得率呈现先升后降趋势，说明培养基含水量过高过低都不利于蛋白肽的发酵生产，试验确定培养基的较好料液比为1.0∶2.0（g∶mL）。与袁建等[22]利用枯草芽孢杆菌固态发酵生产菜籽肽的研究一致，这可能与枯草芽孢杆菌的生长代谢特性有关。

图3 不同料液比对肽得率的影响Fig.3 Effect of different solid-liquid ratio on peptide yield

2.2.4 磷酸二氢钾添加量对肽得率的影响

在葡萄糖添加量5%，料液比1.0∶2.5（g∶mL），拌料水pH=7的条件下，磷酸二氢钾添加量对枯草芽孢杆菌发酵麦糟生产蛋白肽的影响结果见图4。

图4 不同磷酸二氢钾添加量对肽得率的影响Fig.4 Effects of different potassium dihydrogen phosphate addition on peptide yield

磷酸二氢钾除了提供微生物代谢所需的P、K矿质营养元素外，还可以缓冲培养基的pH 值。由图4可见，当磷酸二氢钾浓度低时，随着盐浓度增加，肽得率增加，磷酸二氢钾添加量为0.5%时，肽得率达到最大值11.17%，继续增加磷酸二氢钾的添加量，肽得率逐步下降，原因是高浓度磷酸盐对微生物生长代谢产生抑制作用，因此，枯草芽孢杆菌发酵麦糟生产蛋白肽培养基的较佳磷酸二氢钾添加量为0.5%。

2.2.5 pH值对肽得率的影响

在葡萄糖添加量5%，磷酸二氢钾添加量0.5%，料液比1.0∶2.5（g∶mL）的条件下，拌料水不同pH值对枯草芽孢杆菌发酵麦糟生产蛋白肽的影响见图5。

pH值大小不仅会影响微生物的生长代谢，也会影响蛋白酶及底物的解离状态[23]，从而影响肽得率。由图5可知，在pH5～9范围内，肽得率随着pH值的增加呈先升后降趋势，在配料水pH为7时，肽得率达到最大值。考虑到实际应用生产过程，中性pH对操作和设备的要求低，因此优化试验中拌料水选择在pH=7条件下进行。

图5 不同pH值对肽得率的影响Fig.5 Effect of different pH value on peptide yield

2.3 响应面法优化培养基条件

在单因素试验的基础上，采用响应曲面法的Box-Behnken试验方案优化培养基条件，试验设计及结果见表2。利用Minitab软件对试验数据进行分析，所得回归方程系数显著性检验结果见表3，模型的方差分析结果见表4。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回归系数显著性分析Table3 Significance analysis of regression coefficients

表4 回归模型方差分析Table4 Variance analysis of regression model

由表3可知，模型参数中，A、B、C、A2、B2、C2、AB、AC对肽得率影响极显著（P＜0.01），BC对肽得率影响不显著（P＞0.05）。自变量A、B、C对肽得率的影响大小为A＞B＞C，即葡萄糖添加量＞料液比＞磷酸二氢钾添加量；各因素回归拟合后得到回归方程：

Y=12.26+0.776A+0.552B+0.349C-1.42A2-1.186B2-0.249C2+0.365AB-0.607AC+0.083BC

根据表4回归模型方差分析结果，模型P＜0.01，表明该二次方程模型具有高度的显著性；失拟项P＞0.05，表明模型失拟项不显著；该模型决定系数R2=0.998 2，调整决定系数R2Adj=0.994 8，说明模型拟合度较好，预测值与试验值具有高度相关性，可用该模型预测枯草杆菌发酵麦糟制备蛋白肽在不同条件下的肽得率。

根据回归方程得出不同因子的响应面及等高线分析图，结果见图6。响应面及等高线图可直观反映各因素之间的交互作用对响应值影响程度，曲面越陡，等密度线越密，影响越显著[24-26]。由图6可知，因素A与因素B、因素A与因素C两对交互作用响应图陡峭，表明其对肽得率Y的影响极显著（P＜0.01），而因素B与因素C的交互作用响应图平坦，即其对肽得率Y的影响不显著（P＞0.05）。

图6 各因素交互作用对肽得率影响的响应面和等高线Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the yield of peptide

经过软件分析优化得到的条件为A=0.191 9，B=0.282 8，C=0.515 2，即葡萄糖添加量为4.192%、料液比为1∶2.141、磷酸二氢钾添加量为0.603%，该条件下理论预测肽得率为12.504%。考虑到实际操作，将葡萄糖添加量调整为4.2%，料液比取1.0∶2.1（g∶mL），磷酸氢二钾添加量取0.6%，此条件下重复3次试验，取其平均值，肽得率实际值为12.40%，与预测值差别不大。

3 结论

采用枯草芽孢杆菌发酵生产麦糟蛋白肽过程中，确定了麦糟培养基中添加的最优碳源为葡萄糖。试验发现，葡萄糖添加量、料液比、磷酸二氢钾添加量三因素及其二次项对肽得率影响极显著，在交互作用关系中，葡萄糖添加量与料液比、葡萄糖添加量与磷酸二氢钾添加量间交互作用对肽得率影响极显著。在选择的水平范围内，优化得到的培养基条件是：pH7.0，葡萄糖添加量4.2%，料液比1.0∶2.1（g∶mL），磷酸氢二钾添加量0.6%，该条件下肽得率达12.40%。本试验利用微生物固态发酵麦糟制备蛋白肽方法可行，肽得率高，试验结果可为麦糟蛋白肽的工业化生产提供理论依据，具有较好的应用价值。