耳蜗TRPC6基因导入治疗大鼠噪音性聋的初步研究

单 良,徐雨笠,李 玎,童 军

(同济大学附属上海市第四人民医院 耳鼻咽喉科，上海 200434)

耳聋严重影响人们的生理心理健康。后天性噪音、老年性、耳毒性药物及自身免疫性疾病性耳聋发病率日益增高[1]。耳蜗毛细胞将声音刺激转换为生物电信号，产生听力，因此科学家们一直致力于听毛细胞的再生和损伤修复的研究，近年内耳基因治疗成为热点，即通过导入内耳功能性基因并表达，促进听毛细胞的再生或修复。这些研究已经取得一些突破，如Abdolazimi等[2]通过调控转录因子ATOH1促进毛细胞再生，陈嘉伟等[3]经圆窗膜鼓阶显微注射的方法将腺相关病毒转染小鼠耳蜗，取得良好效果，给了我们促进听毛细胞修复的新理论基础和思路。瞬时受体电势C通道蛋白6(Transient receptor potential canonical ，TRPC6)可在细胞膜上构成非选择性阳离子通道，发挥多种生理功能。在大鼠脑缺血性损伤模型中，TRPC6 蛋白的降解被阻止，进而起到保护神经元[4]作用。TRPC6也是肾脏足细胞重要的裂孔隔膜蛋白，其编码基因发生突变可导致足细胞损伤[5]。TRPC6同样被发现在耳聋康复中发挥作用，但Sexton[6]认为其作用是通过毛细胞代谢还是直接通过保护中枢神经元尚无法确定。本研究将探讨携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein)的TRPC6过表达慢病毒(PHBCMV-TRPC-EGFP)经大鼠圆窗膜注入后，能否成功转染大鼠毛细胞，表达后直接促进毛细胞的修复，治疗大鼠听力损伤。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：健康SD大鼠25只，雄性，200～250 g，(海军医科大学动物实验中心 许可证号：SCXK(沪 2012-0007)。听性脑干反应(ABR)检查示听力正常。TRPC6过表达慢病毒(PHBCMV-TRPC-EGFP)和空病毒(PHBCMV-EGFP)(上海生博生物科学技术有限公司)滴度1.81×108 TU/mL。

1.2 实验方法

1.2.1 噪音性耳聋动物制备(上海海军研究所) 实验大鼠清醒状态下单只放入特制的鼠笼内，置于消声室自由声场中，接受155dB SPL脉冲噪声暴露20次，间隔2 s。

1.2.2 SD大鼠分组 25只SD大鼠，4只操作中死亡，余下21只完成噪音性聋模型制作，随机分为3组,每组7只：TRPC6组，空病毒组，对照组，均取左耳为实验耳。

1.2.3 听性脑干反应(ABR)测试 大鼠于噪音暴露前及暴露后3，10，20 d进行ABR检测(上海眼耳鼻咽喉科医院听力中心，0.1 ms短声，重复率为11.1次/s，滤波带宽150～2 000 Hz，叠加1 000次，扫描周期10 ms。电极正极置于头顶正中皮下，参考电极置于同侧颌面部皮下，地极置于鼻尖皮下。刺激声经耳塞给入。以Ⅲ波消失的刺激强度确定阈值，并至少重复1次。

1.2.4 实验手术操作 TRPC6组和空病毒组大鼠于噪声暴露后1 d行耳后进路经圆窗膜耳蜗注入术。术耳向上，背侧进路：沿耳廓后沟2 mm 处弧形切口，向深处分离，在面神经和二腹肌围成的三角区域内向深处显露听泡，在显微镜下用电钻打开听泡，暴露圆窗龛[7]，用细针穿破圆窗膜，见少许血液和清亮的淋巴液流出，用微量注射器将5 uLTRPC6过表达慢病毒或空病毒缓慢注入耳蜗，理论上2 min。明胶海绵覆盖圆窗膜，清洗消毒后，封闭听泡，分层缝合切口。

1.2.5 耳蜗铺片的制作 耳聋20d ABR检测后，各组大鼠麻醉后处死，取出听泡，暴露耳蜗，在蜗尖挑开一小孔，捅破圆窗膜，并将镫骨轻推入前庭池以打开前庭窗，4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH 7.4)经蜗尖灌注固定耳蜗，然后将耳蜗置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中4 ℃固定24 h，EDTA脱钙，基底膜铺片。免疫荧光染法：PBS浸洗5 min 3次。PBST浸洗40 min(37 ℃)。一抗(Santa Cruz)浸洗37 ℃ 1 h，4 ℃过夜。PBS 5 min×3次。二抗(37 ℃)1 h。PBS 5 min×3次，DAPI 10 min，PBS 5 min×3次，封片。荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察EGFP的表达情况及毛细胞的损伤程度。

2 结果

2.1 ABR阈值测试结果 噪音暴露前3组大鼠ABR阈值比较，差异无统计学意义(F=0.045，P>0.05)。噪音暴露后3 d，3组大鼠ABR阈值比较，差异无统计学意义(F=0.477，P>0.05)。噪音暴露后10 d，3组大鼠ABR阈值比较，差异有统计学意义(F=11.437，P<0.05)，其中TRPC6组与空病毒组和对照组之间差异均有显著性(P=0.01，P=0.00)，空病毒组与对照组之间差异无显著性(P>0.05)。噪音暴露后20 d，3组大鼠ABR阈值比较，差异有统计学意义(F=22.370，P<0.05)，其中TRPC6组同与空病毒组和对照组之间差异均有显著性(P<0.05)，空病毒组与对照组之间差异无显著性(P>0.05，见表1)。

表1 ABR阈值测试结果

2.2 大鼠耳蜗显微镜下大体观察 全部大鼠于造模20 d后取耳泡观察，取材时显微镜下见包括二注射组大鼠在内全部中耳腔清洁，中耳及内耳无炎症、纤维化、出血等反应。

2.3 耳蜗铺片观察 全部大鼠在噪音暴露后20 d行耳蜗铺片观察。TRPC6治疗组和空病毒组大鼠在荧光显微镜下和激光共聚焦显微镜下观察，从耳蜗底圈到顶圈均可见清晰轮廓GFP阳性表达毛细胞，二微注射组大鼠的内毛细胞和外毛细胞都有不同程度的损伤。顶圈毛细胞缺失最多，中圈次之，底圈最少量缺失。这不同于一些文献报道和基底膜行波理论，我们认为可能和耳蜗铺片时器械是由蜗顶往下推，造成Corti器的机械损伤有关，因此我们在图片对比中选取耳蜗中圈铺片进行对比，以避免操作因素的干扰。TRPC6组与空病毒组相比毛细胞缺失较轻。对照组耳蜗铺片未见荧光表达细胞(见图1)。

噪音暴露后20 d耳蜗铺片观察(中圈)，A1、A2： TRPC6组；B1、B2：空病毒组；毛细胞呈现较明显的GFP绿色荧光(红色为激光共聚焦显微镜下观察)×200，TRPC6组较空病毒组毛细胞缺失减轻；C：对照组，耳蜗铺片未见细胞荧光表达。图1 大鼠耳蜗中圈铺片

3 讨论

近年来在动物实验中毛细胞再生研究有所突破性的成果，如通过调节ATOH1表达诱导了毛细胞再生[2，8]。但这种实验中的毛细胞再生还完全不能等同听力的恢复。杨等因此提出了一个时间窗的感念，即损伤后10～12d不能修复将导致毛细胞不可逆死亡[8]。基因治疗是目前内耳治疗最有前景的方式：编码好的外源性功能基因，通过载体(病毒、非病毒)导入内耳，在内耳中表达，调节细胞代谢，从而保护和再生毛细胞[9]。基因转染后持续表达，解决了功能蛋白局部直接注射成本高、容易降解等难题的限制。同时耳蜗空间狭小，相对独立，又有多种屏障维持内耳微环境稳定，内耳又充满了淋巴液，这些特点使内耳非常适合基因导入，并在迷路内转染，同时由于蜗壳和血迷路屏障使内耳相对隔绝，减少了病毒的副作用[10]。因此，基因治疗具有良好的应用前景[11]。

内耳基因递送核心技术是导入途径和有效基因载体。基因导入途径目前主要有保留完整圆窗膜，通过圆窗膜半渗透膜特性方式导入，和开放耳蜗通过微注射或渗透泵持续灌注方式。圆窗膜渗透方式损伤小，在保护内耳结构方面有优势，但选择性透过的特点使其存在相对转导成功率低的问题。微注射途径需要开放耳蜗，该途径转染率高，但也存在药物因为末端的耳蜗导水管与蛛网膜下腔相通而进入脑脊液，造成药物浓度降低以及污染脑脊液可能[12]。微注射位置主要为经圆窗膜和耳蜗底转开放，理论上两者都有一定的内耳损伤，但都仍在可接受范围。经耳蜗底转打孔的方法可转导入前庭阶，较圆窗膜途径转染更迅速，耳蜗及前庭均可获得了良好转染，而通过圆窗导入一周后转染仅局限于耳蜗[13]，但多数学者认为圆窗途径对内耳影响更小[14]。本文研究圆窗途径，噪音暴露后10d和20d，空病毒组和对照组大鼠的ABR均值差异均无统计学意义，验证圆窗膜开孔方法的微创、安全。近年来，也有学者提出经半规管开口导入途径可以完全避免感音功能损伤，对啮齿动物来说，半规管容易暴露，壁软，针头可直接刺入。但由于半规管容积较小[15]，也存在操作中不确定进入膜迷路内淋巴还是外淋巴腔隙中，和导入的病毒容易渗漏的缺点[16]。

用于导入基因的载体有非病毒和病毒载体：非病毒载体具有低毒，无免疫原性的，所携带的基因不整合到宿主细胞等优点[17]，其中纳米材料也有相对高的转染率[18]。病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等。逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，而且容量有限。腺病毒载体能够容纳较大的外源基因片断，然而其转染后可产生细胞免疫反应，因此腺病毒治疗潜力仅限于诱发免疫反应[19]。慢病毒载体是单链RNA病毒，可以感染分裂期、非分裂期细胞，转染率高。其可将目的基因整合入细胞基因组中，在细胞中长期、高效且稳定地表达，慢病毒不产生任何有效的细胞免疫应答[20-21]。EGFP作为报告基因，可显示转染效率[22]。本实验中观察到，使用慢病毒载体，术后20d，荧光显微镜下TRPC6组和EGFP空病毒组耳蜗基底膜、毛细胞均呈现较明显的免疫荧光显示。在激光共聚焦显微镜下，亦可见耳蜗组织获得良好的传染。这些结果表明慢病毒载体介导了TRPC6基因成功转染耳蜗，并在目标细胞内表达。

耳蜗微环境的稳定主要依赖K+循环、Ca2+循环和谷氨酸-谷氨酰胺循环的共同维持。其中Ca2+在耳蜗内广泛分布，具有第二信使作用，各种因素的细胞内Ca2+超载，均可引发细胞损伤[23]。TRPC6可以通过磷酸化的CREB(cAMP)和降低Ca2+超载实现对缺血神经元的保护。目前噪声性聋的代谢损伤理论主要是噪声导致耳蜗毛细胞、内环境发生一系列病理生理改变[23]：在噪声暴露条件下，毛细胞发生去极化，引起毛细胞内Ca2+浓度升高。胞浆内游离Ca2+过多改变了外毛细胞的运动特性而导致机-电转换过程发生病理改变。而转染后过表达的TRPC6离子通道可有效降低胞内钙离子浓度的超载，促进了毛细胞修复。

总之,本实验中，TRPC6基因导入噪音性聋大鼠后ABR阈值恢复较空病毒组和对照组更好，噪音暴露后20d，耳蜗基底膜铺片可见：在显微镜下有荧光蛋白表达的毛细胞，数量较多。该结果提示：TRPC6基因成功导入大鼠耳蜗并表达，可通过直接促进毛细胞的损伤后的修复，对噪音性等听力损失起到有效的治疗作用。