5-氮杂-2'-脱氧胞苷对P57kip2调控JEC细胞生长干扰的研究

周 俊，张春英，李三华，钟 栎，周正平

(1.遵义医科大学 病理学教研室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学 电镜室，贵州 遵义 563099；3.遵义医科大学 医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563099；4.怀化市第一人民医院 病理科，湖南 怀化 418000)

子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，子宫内膜样癌(Endometrial carcinoma,EC)是其主要组织学类型。2020年美国子宫内膜癌约有65 620例新发病例，12 590死亡病例，其发病率每年上升1.3%，到2030年总病例数预计会达到1023 290例，在美国女性好发肿瘤中，子宫内膜癌为仅次于乳腺癌的第二大高患病率肿瘤[1-2]。研究证明，子宫内膜癌的高危因素主要是长期无孕激素拮抗的高水平雌激素环境刺激，但其发生发展的确切机制目前尚不清楚，可能与细胞周期异常调控、表观遗传修饰有关[3-4]。

p57kip2在细胞周期调控过程中，通过阻滞细胞从G1期到S期转变，从而抑制细胞增殖[5]。p57kip2在大多数肿瘤组织中，未见基因突变事件，其异常表达主要与表观遗传修饰有关，如DNA甲基化和组蛋白乙酰化[6]。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，在调节基因表达中起着重要作用，主要发生在基因启动子区CpG岛，在甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化下，甲基与5’端的胞嘧啶(C)残基结合，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)[7]。

在DNA复制循环过程中，通过抑制DNMT活性、酶促5-mc降解等方式脱去甲基，可逐渐下调基因组甲基化水平[8-9]。在肿瘤中，DNMT抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)通过取代C与DNMT半胱氨酸残基上的氢硫基(-SH)共价结合，使DNMT失活从而下调肿瘤抑制基因甲基化水平。本实验使用不同浓度5-Aza-CdR干扰人EC中分化JEC细胞不同时间段后，检测不同甲基化水平的p57kip2对细胞生长的影响，为指导临床进一步开展子宫内膜样癌的靶向药物治疗提供一定的实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 JEC细胞株(中分化)由遵义医科大学微生物教研室提供[10]。5-Aza-CdR购自MACKLIN公司；MTT相关试剂购自南京凯基公司；WB相关试剂均购自上海碧云天生物研究所；p57kip2兔抗人单克隆抗体、二抗(山羊抗兔)购自Abcam公司；RPMI 1640培养液、南美胎牛血清购自美国Gibco公司。CO2细胞培养箱、酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；倒置显微镜CKX41(日本OLYMPUS公司)；扫描电子显微镜SU8010(日本日立公司)；Odyssey双色红外激光成像系统(美国LI-COR公司)；流式细胞仪(德国Beckman公司)；BSP 检测由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 浓度为12.5 μmol/L和15 μmol/L的5-Aza-CdR干扰JEC细胞作为实验组(A组：12.5 μmol/L；B组：15 μmol/L组；A+、B+组：分别为A、B组于48h追加一次等量5-Aza-CdR)，对照组则加等量不含任何药物的完全培养基进行细胞培养。

1.2.2 亚硫酸氢盐测序(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)法检测各组JEC细胞中p57kip2基因启动子区甲基化水平 将实验组和对照组分别培养24、48、72 h后，消化离心后收集细胞，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成p57kip2基因启动子区32个CpG位点甲基化率检测。

1.2.3 MTT法检测各组JEC细胞增殖 以100 μL/孔接种于96孔板上，每组5个复孔，等待细胞贴壁后加入不同浓度的5-Aza-CdR，分别于24、48、72 h取出对应96孔板，吸出孔内残余液体，PBS冲洗后吸尽残液，避光操作加20 μL MTT溶液，于CO2细胞培养箱继续反应，4 h后吸出上清溶液，避光分别加入二甲基亚砜(DMSO)100 μL，避光水平避光摇晃10 min，使用酶标仪(波长490 nm)检测OD值。

1.2.4 Western blot法检测各组JEC细胞中P57kip2蛋白表达 5-Aza-CdR干扰实验组和对照组24、72 h，于冰上裂解30min提取蛋白，制胶后电泳，根据Maker切下57kDa(p57kip2蛋白分子量57kDa)所在范围的凝胶，电转至PVDF膜上再封闭，一抗(p57kip2、β-actin稀释比例分别为1∶500和1∶1 000)4℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗(稀释比例1∶10 000)室温摇床孵育2 h，再洗膜3次，最后上机曝光检测。

1.2.5 流式细胞术分析各组JEC细胞周期分布情况 5-Aza-CdR干扰实验组和对照组24、72 h，1 000 rpm离心3 min，去上清液，加入70%乙醇于4 ℃冰箱固定，次日将细胞于3 000 rpm离心5 min，去上清，PBS清洗后再离心，吸尽上清，加入100 μL RNase A溶液，于37 ℃水浴箱反应30 min，最后加入400 μL PI染色液，混匀后4 ℃避光孵育30 min后上机检测。

1.2.6 光镜、电镜观察各组JEC细胞形态结构变化 5-Aza-CdR干扰实验组和对照组72 h后：①使用倒置显微镜观察JEC细胞生长情况；②双重固定、梯度脱水后，临界点干燥，粘托，镀膜，扫描电子显微镜(SEM)下观察JEC细胞表面超微结构。

2 结果

2.1 5-Aza-CdR干扰后p57kip2基因启动子区甲基化水平 和对照组比较，在24、48 h以A、 A+组总体甲基化率下降明显，在72 h以A+、B+组下降明显；随着时间延长，对照、A、B组持续升高， A+、B+组在72 h再次下降(见表1，图1)。

表1 5-Aza-CdR干扰JEC细胞24、48、72 h后p57kip2基因启动子区总体甲基化率(%)

图1 5-Aza-CdR干扰24 、48、72 h后JEC细胞p57kip2基因启动子区甲基化情况

2.2 5-Aza-CdR干扰后JEC细胞生长水平 相同作用时间：和对照组比较，在24 h，A、A+组细胞生长水平下降有统计学意义且分别低于B、B+组(P<0.05)，B、B+组下降不明显(P>0.05)；在48 h，各实验组均有明显下降(P<0.05)；在72 h，A、B组无明显下降(P>0.05)，A+、B+组明显下降且分别低于A、B组(P<0.05)。

相同药物浓度：随着时间延长，对照组的细胞生长水平持续上升(P<0.05)；24 h到48 h各实验组细胞生长水平均上升，仅A+组上升明显(P<0.05)；48 h到72 h，A、B组持续上升，仅B组差异有意义(P<0.05)，A+、B+组呈下降趋势，仅B+组下降有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 5-Aza-CdR干扰JEC细胞生长水平

2.3 5-Aza-CdR干扰后JEC细胞中P57kip2蛋白的表达情况 相同作用时间：和对照组比较，在24 h，A、A+组P57kip2蛋白的表达明显上调且分别高于B、B+组(P<0.05)，B、B+组上调不明显(P>0.05)；在72 h，A、B组上调不明显(P>0.05)，A+、B+组明显上调且分别高于A、B组(P<0.05)。

相同药物浓度：24 h到72 h，A、B组中P57kip2蛋白表达均下调，仅A组有统计学意义(P<0.05)，A+、B+组中P57kip2蛋白表达均有显著上调(P<0.05，见表3，图2)。

表3 5-Aza-CdR干扰JEC细胞24、72 h后P57kip2蛋白表达

图2 不同浓度5-Aza-CdR干扰后JEC细胞后P57kip2蛋白的表达情况

2.4 5-Aza-CdR干扰后JEC细胞周期分布情况 相同作用时间：和对照组比较，24 h各实验组中处于G1期的细胞比例均有大幅度增高(P<0.05)，处于S期的细胞比例下降，除A组外，其他实验组均有明显下降(P<0.05)，处于G2期的细胞比例下降，仅A、A+组下降明显(P<0.05)，周期的分布比例在各实验组之间均无明显差异(P>0.05)；72 h中A+、B+组G1期细胞比例明显增高且分别高于A、B组(P<0.05)，A、B组增高不明显(P>0.05)，S期细胞比例下降，除B组外(P>0.05)，其他实验组均有明显下降(P<0.05)，且A、A+、B+组分别低于B、A、B组(P<0.05)，G2期细胞比例增高不明显(P>0.05)。

相同药物浓度：24 h到72 h，对照组中S期细胞比例呈上升趋势(P<0.05)，G1、G2期无明显变化(P>0.05)，A、B组G1期细胞比例呈下降趋势(P<0.05)，S期细胞比例呈上升趋势，仅B组有意义(P<0.05)，A+、B+组G1期细胞比例呈上升趋势，其中B+组上升明显(P<0.05)，S期细胞比例呈下降趋势(P<0.05)，各实验组G2期细胞比例均有上升，仅A、A+组差异有意义(P<0.05，见表4，图3)。

表4 5-Aza-CdR干扰JEC细胞后周期分布情况

A：对照组24 h细胞周期分布情况； B：对照组72 h细胞周期分布情况；C：A组24 h细胞周期分布情况； D：A组72 h细胞周期分布；E：B组24 h细胞周期分布情况；F：B组72 h细胞周期分布情况；G：A+组24 h细胞周期分布情况；H：A+组72 h细胞周期分布情况；I：B+组24 h细胞周期分布情况；J：B+组72 h细胞周期分布情况。图3 5-Aza-CdR干扰JEC细胞后周期分布情况

2.5 5-Aza-CdR干扰后JEC细胞形态变化 倒置显微镜观察：JEC细胞呈不规则形或长梭形，可见明显的围腺腔样结构。培养至72 h，和对照组比较，A、B组的细胞密度无明显变化，A+、B+组的细胞密度明显减小(见图4)。

扫描电镜观察：JEC细胞呈球形，培养至72 h，和对照组比较，实验组细胞表面微绒毛和分泌泡均更加丰富，其中A+、B+组更明显(见图5)。

A：对照组细胞生长情况；B：A组JEC细胞生长情况；C： A+组JEC细胞生长情况；D：B组JEC细胞生长情况；E： B+组JEC细胞生长情况。图4 JEC细胞72 h后的细胞生长情况(×100)

A：对照组细胞超微结构；B：A组JEC细胞超微结构；C： A+组JEC细胞超微结构；D：B组JEC细胞生长情况；E： B+组JEC细胞生长情况。图5 5-Aza-CdR干扰72 h后JEC细胞形态结构

3 讨论

表观遗传学的概念最初由英国生物学家Waddington于1942年提出，它是基因型和表型之间的桥梁，这种修饰现象改变了基因组或染色体的表达，但没有改变DNA序列。DNA甲基化是基因表观遗传修饰的主要方式，在发育障碍、衰老和肿瘤形成的过程中都存在DNA甲基化改变[11-12]。

p57kip2作为一种候选的抑癌基因，在胃贲门腺癌、肝细胞癌、胆囊癌等组织中表达有明显下调[13-15]。过去的研究认为，抑癌基因的异常表达与基因突变有关，目前通过对抑癌基因启动子区CpG岛的过度甲基化研究，认为抑癌基因启动子区CpG岛的过度甲基化是抑癌基因失活的一个重要机制[16-17]，p57kip2基因转录起始位点的上游和下游均富含大量CpG岛，从而致使其转录后易受表观遗传修饰[18]。在正常细胞中，肿瘤抑制基因启动子区的CpG岛处于低甲基化或非甲基化状态，发挥抑制细胞周期、防止细胞异常增殖等功能；当肿瘤抑制基因启动子区的CpG岛被高度甲基化，染色质构象发生改变，肿瘤抑制基因表达受抑制，甚至处于沉默状态，使细胞不受控制的增长，最终导致肿瘤发生[19]。

Yang等[20]研究发现，在人结肠癌HCT116细胞中，5-Aza-CdR能有效抑制细胞增殖，随时间延长，这种抑制状态会逐渐逆转。5-Aza-CdR通过抑制DNMT的活性从而降低抑癌基因的高甲基化水平并恢复其表达[21]，在临床上主要用于治疗骨髓增生异常综合征(MDS)，5-Aza-CdR联合化疗的方案已在难治或复发的急性髓细胞性白血病(AML)患者中治疗中效果较好[22]。本课题组前期研究[23]发现：5-Aza-CdR能降低JEC细胞中p57kip2基因启动子区的总体甲基化率，其中12.5 μmol/L比15 μmol/L下降更明显；随着时间延长，未追加药物的12.5、15 μmol/L两个浓度组中p57kip2基因启动子区部分位点出现再甲基化，总体甲基化率上升，本次研究发现，追加药物的12.5、15 μmol/L两个浓度组总体甲基化率在72 h出现下降，提示5-Aza-CdR能使p57kip2基因启动子区的高甲基化水平下降，但需要追加5-Aza-CdR来维持其去甲基化作用。

Dastjerdi等[24]的研究显示：使用5-Aza-CdR处理人胰腺癌PNAC-1细胞可导致RASSF1A基因启动子区部分去甲基化，且5-Aza-CdR去甲基化表现出时间依赖性、剂量依赖性：随着试验时间延长实验组表现出明显的抑制细胞生长作用。Perrard等[25]发现，5-Aza-CdR能下调宫颈癌HPV阳性SiHa和Ca-Ski细胞中HPV E6蛋白表达，并具有明显的时间依赖性；但E6下调水平在不同浓度并未发现差异。我们研究发现：与对照组比较，各实验组细胞中P57kip2蛋白表达量以及G1期细胞比例均有不同程度上升，细胞生长水平均有不同程度下降，这种变化趋势在24 h中12.5 μmol/L比15 μmol/L表现更明显(P<0.05)，到72 h后则以追加药物的12.5、15 μmol/L两个浓度组表现更加明显(P<0.05)，同时还伴随S期的细胞比例下降(P<0.05)、G2期比例上升(P>0.05)、细胞密度减小以及细胞表面有更加丰富的微绒毛和分泌泡等促细胞向好分化方向发展的表现；从24 h到72 h，未追加药物的12.5、15 μmol/L两个浓度组蛋白表达、G1期细胞比例下降，S期和G2期的细胞比例、细胞生长水平上升，而追加药物的12.5、15 μmol/L两个浓度组蛋白表达、G1期细胞比例上升，S期和G2期的细胞比例、细胞生长水平下降(P<0.05)，提示5-Aza-CdR的去甲基化作用存在时间依赖性，追加药物能持续上调P57kip2蛋白表达和G1期细胞比例，从而抑制细胞生长，且12.5 μmol/L的去甲基化效果比15 μmol/L更好，不具有浓度依赖性，这和Perrard等[25]的研究结果相似，与Dastjerdi等[24]的研究结果不一致，这可能与不同组织的肿瘤、不同细胞系的内在基因组表观特征不同，以及对5-Aza-CdR的敏感性不同有关。

综上所述，在JEC细胞中，5-Aza-CdR能降低p57kip2基因启动子区总体甲基化水平，但存在时间依赖性，随着时间延长，部分位点会复甲基化，追加5-Aza-CdR能维持p57kip2启动子区的总体甲基化水平，持续上调P57kip2蛋白的表达，从而使更多细胞被阻滞于G1期，发挥其负向调控细胞周期进程、抑制JEC细胞生长的功能，并有促进细胞向更好分化方向发展的趋势。