市政尾水排污口附近海洋底泥细菌微生物群落组成研究

徐爱玲，郭明月，宋志文，乔凤禄，李慧娟

(青岛理工大学 环境与市政工程学院，青岛 266033)

底泥作为水体生态环境的重要组成部分，成分极其复杂，不仅是氮、磷、有机物等营养物质的接纳库，也是水体中悬浮颗粒物和化学污染物的释放源，更含有丰富的微生物源。底泥微生物是生态环境中物质循环和能量流动的主要动力，如碳循环、氮循环[1]、腐殖质分解和合成以及厌氧菌对磷、硫、铁以及重金属形态转化等。底泥微生物作为食物链中复杂的生物群体，对整个生态系统稳定具有重要的作用。

关于物候期的变化、产量的提高、品质的提升，也与今年葡萄管理和今年的气候条件有关，试验的葡萄园今年无论是施用本然的还是施用化肥的，产量都提高了，同时，检测手段还不先进，所以在研究本然土壤调理剂的作用的时候要充分考虑这些因素[4]。

青岛是我国东部沿海重要的经济中心城市，位于山东半岛东南部沿海，东、南濒临黄海，海域面积约1.22万 km2，海岸线总长为816.98 km，海洋旅游业已经成为青岛市的优势产业，同时也向海洋环境提出了更高的要求。青岛市的18家污水处理厂均采用直接排海或先排河后排海的方式进行尾水排放[10]，其高排放量对海域底泥环境产生巨大影响。因此，本文选取青岛市3种不同排海方式市政排污口附近海域底泥作为研究对象，对其细菌群落组成、优势菌群、致病菌进行分析，揭示不同排海方式对细菌微生物群落和功能细菌微生物的变化规律及季节差异规律，以期为城市合理尾水排海方式的研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 研究区域及采样点设置

设置三个采样点，其中A为青岛海泊河污水处理厂排污口附近海域，B为青岛麦岛污水处理厂排污口附近海域，C为青岛第二海水浴场雨水排放口附近海域，采样点附近海域水质理化指标背景值见表1。其中海泊河污水处理厂采用MSBR处理工艺，处理污水量占全市的40%左右，排水方式为加氯消毒后先排入海泊河后再进入胶州湾，出水达到一级A标准；麦岛污水处理厂采用Biostys生物滤池处理工艺，污水经预处理后通过DN1000、长1030 m的管道直接排入深海中，出水达到一级B标准；第二海水浴场位于汇泉湾东侧的太平湾内与八大关别墅区相邻的一处沙滩浴场，为雨水管道直接排污点，作为背景值。

别看我表面上镇定，心里早就发毛了。纸里是包不住火的，在我们村，屁大点事都藏掖不住，不用说我也知道，我强奸李金枝的事肯定传播得像苍蝇一样无处不在了。我感觉马兰眼里甩出来两条鞭子，劈劈啪啪抽打着我的全身。

在受不同排海方式的影响下，三个研究区域底泥样品的细菌微生物群落组成进行门水平的分类统计如图2所示。12个底泥样品中共检测到35个菌门，其中，在A取样点(先排河后排海)四季分别检测出29，31，32，27个菌门，在B取样点(直接排海)四季分别检测出27，26，29，28个菌门，在C取样点(雨水管道排放)四季分别检测出29，29，31，29个菌门。相对于其他排放方式，直接排放附近海域底泥样品菌门的数量较低。主要包括变形菌门( Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门( Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和浮霉菌门( Planctomycetes)等，其中变形菌门( Proteobacteria)相对丰度均在36%以上表现出绝对优势。通过横向排海方式对比发现，厚壁菌门( Firmicutes)在B点(直接排海)相对丰度较高，秋季最高为48.23%超过变形菌门( Proteobacteria)；放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和蓝藻门(Cyanobacteria)在C取样点(雨水管道排放)相对丰度高于其他取样点；绿弯菌门(Chloroflexi)和浮霉菌门( Planctomycetes)在A取样点(先排河后排海)的相对丰度远高于其他取样点；其他菌门受排海方式的影响未出现明显规律变化。通过纵向四季对比发现，秋冬季厚壁菌门( Firmicutes)的相对丰度高于春夏季；放线菌门( Actinobacteria) 在夏季的相对丰度远低于其他季节，在C取样点(雨水管道排放)拟杆菌门( Bacteroidetes)夏季出现骤降现象。

表1 样品附近海域水质理化指标背景值

1.2 样品采集

三个研究区域底泥样品的细菌微生物群落组成纲水平分类统计如图3所示。12个底泥样品中共检测到73个菌纲，其中，在A取样点(先排河后排海)四季分别检测出67，81，58，61个菌纲，在B取样点(直接排海)四季分别检测出63，59，61，59个菌纲，在C取样点(雨水管道排放)四季分别检测出70，76，58，59个菌纲。相对于其他排放方式，直接排放附近海域底泥样品菌纲的数量较低。主要由γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、黄杆菌纲(Flavobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)和拟杆菌纲(Bacteroidia)组成。通过横向排海方式对比发现，ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、螺旋菌纲(Spirochaetes)和柔膜菌纲(Mollicutes)在B取样点(直接排海)的相对丰度明显高于其他取样点。通过纵向四季对比发现，芽孢杆菌纲(Bacilli)和放线菌纲(Actinobacteria)在秋冬季节的相对丰度明显高于春夏季节，而酸微杆菌纲(Acidimicrobiia)只在春夏季节可以检测出来。β-变形菌纲(Betaproteobacteria)在冬季的相对丰度明显高于其他季节，黄杆菌纲(Flavobacteria)在秋季出现骤降现象。δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)和α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)的占比在B点(直接排海)夏季出现骤降现象，而梭菌纲(Clostridia)和拟杆菌纲(Bacteroidia)在C取样点(雨水管道)冬季出现骤增现象。

1.3 总DNA 提取与检测

三个研究区域四季底泥样品中A取样点(先排河后排海)的Chao 1 指数和ACE 指数在春季、秋季、冬季均高于其他地点的底泥样品，而夏季C取样点(雨水管道排放)的Chao 1 指数和ACE 指数高于其他地点的底泥样品，说明受排海方式的影响，在除夏季之外的季节，细菌群落的丰富度表现为：先排河后排海>雨水管道>直接排海；在夏季受雨水季节以及旅游旺季的影响，雨水管道排放附近海域底泥的群落丰富度较高。纵向季节对比发现，底泥样品的群落丰富度在夏季和冬季最高，秋季次之，春季最低。所有样品Simpson指数均在0.981 57～0.997 39之间。通过整体样品对比发现，Chao 1和ACE指数所反映出的细菌丰富度与稀释曲线表现的情况一致(表3)。

表2 DNA提取情况

2 结果与分析

2.1 物种丰度

2.1.1 OTU稀释曲线

中国在全球奢侈品市场扮演的重要角色已无需解释，值得注意的是，过去一年，拥抱互联网和电商正逐渐成为钟表行业的主流趋势，特别在中国市场，不少代表传统钟表业核心价值的高端品牌正突破以往束缚，大胆试水线上渠道。

随着测序深度的增加12个样品的稀释曲线趋于平缓，表明此时样品的库容已经涵盖该位点的绝大部分细菌菌群。整体来说，B取样点(直接排放)的OTU数在四季相对较低，尤其夏秋季节，说明尾水直接排放处附近海域底泥中细菌微生物群落丰富度最低(图1)。

2.1.2 α多样性分析

称取约0.25 g的底泥样品，采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit提取样品中的总DNA，通过微量核酸蛋白分析仪对提取后的DNA 浓度与纯度进行检测，全部DNA样品波长260 /280 值均在1.7～1.9(表2)。检测合格的基因组DNA 样品交由派森诺公司对其进行Illumina MiSeq高通量测序。

表3 样品菌群微生物α多样性指数

2.2 门水平分析

教师们提到，影响小学教师情绪劳动表现的因素主要有教师与学生、同事、家长等各种关系状况，种种关系的交织状态所形成的教师对学校文化的自我感知更是影响小学教师情绪劳动表现的重要因素之一，因此有必要探究小学教师眼中理想的学校文化类型，以期更好地助益实践。下面根据访谈资料从教师的期望中捕捉有助于他们情绪展现的理想学校文化特征。

图2 不同排海方式下底泥样品在门水平群落分类学组成和丰度分布

2.3 纲水平分析

分别于2017年11月、2018年1月、7月和11月用已灭菌的柱状采泥器采集表层(0～20 cm) 底泥样品，每个断面采集3—4 个重复，分离时用活塞自下而上将泥柱推出，并将泥样每隔5 cm 分层，置于无菌自封袋中，2 h内送回实验室并尽快提取DNA ，用于PCR扩增。

图3 不同排海方式下底泥样品在纲水平群落分类学组成和丰度分布

2.4 种水平分析

底泥是一个物质交换频繁、微生物种类丰富、生物活性高的特殊环境。本研究发现，排海方式为先排河后排海的排污口附近底泥样品细菌微生物群落丰富度除夏季外均高于其他排海方式，原因可能是先排河后排海的排海方式交换能力较高、稳定性较差，对底泥中微生物有稀释作用。而夏季在雨水管道排放处群落丰富度最高，考虑由于雨水管道排放处的取样点为青岛第二海水浴场，夏季又是青岛旅游旺季，受气温和人类活动的影响，其群落丰富度最高，而直接排海有利于提高微生物群落多样性。显示底泥样品的群落丰富度在夏季和秋季最高，春季次之，冬季最低，这与其他研究[11-12]存在显著差异。其主要原因是受季节污水处理量的影响，冬季气温低，底泥微生物活性较低，城市用水量也较少，而夏秋季受气温和人类活动的影响，底泥中细菌大量生长繁殖，因此夏秋季细菌群落丰富度偏高；冬季受气温和排水量的影响，在气温较低排水量减少的情况下，冬季细菌群落丰富度最低。因此，各区域的底泥微生物多样性和丰富度在季节和空间上存在显著差异[13]。这与徐爱玲等研究的城市尾水排海过程中的细菌微生物群落丰富度和多样性的结果[9]相一致，由此也可总结出底泥与水体环境中微生物多样性和丰富度相互响应。

图4 不同排海方式下相对丰度大于1%的种水平群落分布

3 讨论

对排海方式影响下三个研究区域四季底泥样品的细菌微生物群落组成中相对丰度大于1%的优势菌种进行分类统计如图4所示。12个样品共检测出优势菌种68种，在A点(先排河后排海)四季的底泥样品中分别检测出7，2，7，5种，在B点(直接排海)四季的底泥样品中分别检测出9，11，11，8种，在C点(雨水管道排放)四季的底泥样品中分别检测出1，3，9，10种。整体来说直接排海的排放方式在春、夏、秋季会增加优势菌的种类，而雨水管道排放在冬季会增加优势菌的种类。其中水单细胞菌(Pelomonasaquatica)和布鲁氏菌(Brucellamicroti)在A取样点冬季样品中相对丰度分别为16.18%和12.71%，表现出绝对优势；秋季Lactococcuspiscium在三个取样点的相对丰度分别为5.57%，11.99%和13.05%，表现出绝对优势，其他季节没有发现。Propionigeniummaris只在A点(先排河后排海)处发现，秋季B点(直接排海)的优势菌表现出的相对丰度明显高于其他地点；春季和夏季三个取样点的样品所研究的优势菌的相对丰度都小于10%，且变化幅度较小，没有呈现出明显的变化规律。

12个底泥样品中共检测到34个菌门，优势菌门主要有变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)，这与张承铭的研究结果[14]一致。研究[15]发现厚壁菌门(Firmicutes) 丰度与营养化指数呈显著正相关，而在B取样点污水处理厂特有的Biostys曝气生物滤池脱氮除磷[16]导致厚壁菌门(Firmicutes)在直接排海处相对丰度较高。由于放线菌门( Actinobacteria)是革兰氏阳性细菌，在有机质分解过程中起重要作用[17]，而秋冬季节是青岛第二海水浴场浒苔暴发的季节，在一定时间内导致有机物含量增加[18]，这也是秋冬季节放线菌门( Actinobacteria)以及蓝藻门(Cyanobacteria)在雨水排放口相对丰度较高的原因。有研究[19]报道疣微菌门(Verrucomicrobia)、绿弯菌门(Chloroflexi)和浮霉菌门(Planctomycetes)是广泛存在于底泥环境中的。冬季气温低，底泥中污染物的释放量和微生物的酶活性均较低，微生物的新陈代谢能力低，导致冬季细菌微生物群落丰度出现降低现象。

第四，共享经济的运作离不开信息技术平台这一关键媒介和载体，互联网与信息技术是保障共享经济顺利运行的重要保障，能够为其带来很多支持与便利。

由于底泥环境为兼性厌氧或者发酵环境，海水流量以及河流的补给，导致底泥环境和营养物质发生改变[20]，对底泥中的细菌微生物群落组成产生一定的影响，而直接排海在这三种排海方式中流量最小，因此，直接排放附近海域底泥样品菌纲的数量较低，并且变形菌纲(Epsilonproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、拟杆菌纲(Bacteroidia)等厌氧菌纲在直接排海方式下的相对丰度高于其他取样点。秋冬季节是海水富营养化、浒苔暴发的季节，底泥中的有机物含量增加，异养菌丰度增加[21]，因此，芽孢杆菌纲(Bacilli)在秋冬季的相对丰度明显较高。夏季温度升高，δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)和α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)的占比在直接排海的方式下夏季出现骤降现象，有研究报道[13]温度是影响底泥中细菌群落组成的重要因素。β-变形菌纲(Betaproteobacteria)在冬季的相对丰度明显高于其他季节，造成这种现象的主要原因是β-变形菌纲(Betaproteobacteria)中包含肠胃疾病和口腔疾病的致病菌，这符合张乾[22]曾报道胃肠道比较容易在冬季发难的结论，冬季气温低，河道底泥容易缺氧，并增加梭菌纲(Clostridia)和拟杆菌纲(Bacteroidia)的丰度，这与林国荣等[21]的研究结果相一致。

三个研究区域四季底泥样品的细菌微生物群落组成中相对丰度大于1%的优势菌种有68种，这远远大于本课题组前期对尾水的研究[8-9]。可见底泥是微生物的主要栖息地和储存库，与尾水水体进行能量和物质交换，并与水体环境互相响应。而相较于其他尾水排放方式，尾水直接排放对尾水稀释较快，底泥中营养物质浓度较低，故优势菌种数量相对较低。秋季乳酸乳球菌属(Lactococcusspp.)在三个研究区域均表现出绝对优势，乳球菌属(Lactococcusspp.)是主要发酵菌剂之一，河道底泥为其生长提供了兼性厌氧环境，而秋季是水体富营养化的季节，河道底泥中营养成分较复杂，促进其生长繁殖；有研究[23-25]发现乳球菌属(Lactococcusspp.)可以调节肠胃、呼吸等功能，对鱼类的生长起到促进作用。产丙酸菌属(Propionigeniumspp.)广泛分布于淡水底泥中，而笔者只在A点(先排河后排海)处发现，原因可能是先排河后排海处河流流量较大，扩散距离增加促使其生长。

空气龄(Age of Air)是指房间内某点处空气在房间内已经滞留的时间，反映了室内空气的新鲜程度，可以用来衡量房间内空气的新鲜程度和通风换气效果，是评价室内空气的重要指标.这一概念最早是由SANDBERG[9]在20世纪80年代提出的.某处空气龄越小，则空气越新鲜，空气品质也就越好.图6为各断面平均空气龄(Mean Age of Air)分布图.Y=0.8 m、Y=1.2 m与Y=1.6 m处工作区平均空气龄为110～283 s，办公区域空气龄并不是很大，且越接近送风口，办公室内的平均空气龄数值越小，空气便越新鲜，空气品质也就越高.

笔者在冬季A取样点(先排河后排海)发现致病菌Pelomonasaquatica和Brucellamicroti的占比高达16.18%和12.71%，水单细胞菌(Pelomonasaquatica)是皮肤、呼吸道和肠道的主要致病菌；布鲁氏菌(Brucellamicroti)可引起人畜共患性全身传染病，主要表现症状为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大等，该病进入慢性期可能引发多器官和系统损害，造成不孕不育，严重者可导致死亡，由于它的广泛传播和极大危害已经对部分地区人们的健康和经济造成极大的影响。假交替单胞菌属(Pseudoalteromonasspp.)是一种海洋底泥中常见的鱼类条件致病菌，由于A取样点附近海域有水产养殖，该菌属相对丰度更高一点；而在秋冬季节致病菌种类和丰度明显增多。尾水底泥中存在的各种致病菌不仅能降低水产养殖的产量和质量，而且对附近海域活动的人群健康也有很大威胁，青岛作为著名的旅游胜地，建议相关部门加强对海滨附近海域的致病菌检测，尤其是人口流量大的区域。

4 结论

1) 尾水先排河后排海排放附近海域底泥中细菌分布在27—32个菌门，58—81个菌纲，四季相对丰度大于1%的优势菌种分别有7，2，7，5种；尾水直接排海排放附近海域底泥中细菌分布在26—29个菌门，59—63个菌纲，四季相对丰度大于1%的优势菌种分别有9，11，11，8种；雨水管道排海排放附近海域底泥中细菌分布在29—31个菌门，58—76个菌纲，四季相对丰度大于1%的优势菌种分别有1，3，9，10种，相对于其他排海方式，直接排放处菌门、纲种类数量较少，优势种的种类较多。除夏季外先排河后排海排放的细菌微生物群落丰富度最高，雨水管道排放次之，直接排海排放最低。优势菌门有变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，优势菌纲主要集中在α-变形菌纲、γ-变形菌、δ-变形菌纲和黄杆菌纲。底泥微生物受季节变化以及排海方式的影响，导致补给水、海水流量、海水环境发生变化，进而导致底泥环境以及底泥中的营养物质发生改变，从而使底泥中的细菌微生物群落组成发生改变并随着季节呈现规律性的变化。

2) 秋冬季节在尾水间接排放附近海域底泥中检测出的致病菌Pelomonasaquatica占比高达16.18%，可引起皮肤、呼吸道和肠道等疾病，同时检测出的致病菌Brucellamicroti的占比达到12.71%，是人畜共患性全身传染病的致病菌，相关部门应该加强对这两种致病菌的监测力度。