慢性乙型病毒性肝炎患者维生素D及其受体表达与炎症损伤程度及肝细胞癌发生的相关性分析

李玉苓 邹东花 谭艳 张卫民 孙韬

我国是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染高发国家，HBV感染造成肝脏反复损伤和修复可导致慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）、肝硬化、肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）发生［1-2］。近年研究证实，维生素D（Vitamin D，VitD）具有抑制细胞增殖、调节机体免疫、抑制肿瘤浸润和转移等作用［3-4］。VitD 生物学效应主要由细胞内特异性VitD 受体（Vitamin D receptor，VDR）介导，肝癌细胞可能是VitD 和VDR 作用的靶细胞［5］。HBV 导致CHB、HCC的发病机制尚未完全阐明，目前认为，HBV 通过诱导机体免疫反应，分泌多种炎性细胞因子，导致肝脏炎症表现［6-7］。基于此，本研究尝试分析CHB 患者VitD及其受体表达与炎症损伤程度及HCC 发生的相关性，为HCC防治提供理论依据。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年6月至2020年6月沧州市传染病医院中西医结合肝病科102 例CHB 患者作为研究对象，根据其是否发生HCC 分为HCC 组20 例、非HCC 组82 例。纳入标准：均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》［8］中CHB 诊断标准；HCC组均符合《原发性肝癌诊疗规范（2017年版）》［9］中HCC 诊断标准；临床治疗需要进行肝穿刺活检；患者及家属知情同意。排除标准：伴酒精性肝病、药物性肝损伤、心血管疾病、自身免疫性疾病；合并甲型、丙型、丁型、戊型肝炎病毒及EB 病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）、巨细胞病毒（CytoMegalo Virus，CMV）、人类免疫缺陷病毒（AcquiredImmune Deficiency Syndrome，AIDS，HIV）感染；恶性肿瘤。本研究经我院伦理委员会审批通过。

1.2 方法

①肝组织VDR、VDRmRNA、VDR 蛋白检测：进行超声引导下肝活检，采用Power Vision TM 二步免疫组化法检测VDR 表达，显微镜下观察结果，细胞呈棕黄色为阳性。采用实时荧光定量PCR 法测定VDRmRNA：提取肝组织总RNA（美国Invitrogen 公司Trizol 试剂），逆转录合成cDNA，Taq DNA聚合酶作用下合成PCR 产物，PCR 反应参数：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 个循环，根据待测基因与管家基因的Ct 值，VDRmRNA相对水平用RQ 值（2-ΔΔCt）表示。采用Western blot 法检测VDR 蛋白，艾菲生物技术有限公司兔抗人VDR 多克隆抗体，美国Bioworld公司抗GAPDH 抗体，提取肝组织蛋白，电泳、转膜、封闭，加一抗、二抗，行化学发光反应、曝光、显影，扫描图片，计算VDR 蛋白与GAPDH 灰度比值。②血清VitD、IL-6、Hs-CRP、TNF-α 检测：采集静脉血5 mL，离心（15 min，半径8 cm，转速3 500 r/min），取血清，VitD 采用瑞士罗氏全自动电化学发光分析仪Cobas e602 检测；IL-6、Hs-CRP、TNF-α以酶联免疫法检测，武汉新启迪生物科技有限公司试剂盒。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS 22.0 处理数据，计数资料以n（%）描述，行χ2检验。计量资料以（）描述，两组间用t检验；影响因素采用Logistic 回归分析；双变量正态分布采用Pearson 分析相关性；预测价值采用受试者工作特征（ROC）曲线，联合预测实施Logistic 二元回归拟合，返回预测概率logit（p），将其作为独立检验变量。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料、VitD、VDR 表达等比较

两组年龄、吸烟、饮酒、HBV DNA、IL-6、Hs-CRP、TNF-α、VitD、VDRmRNA 及蛋白表达相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组临床资料、VitD、VDR 表达比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data，VitD and VDR expression between 2 groups［n（%），（±s）］

表1 两组临床资料、VitD、VDR 表达比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of clinical data，VitD and VDR expression between 2 groups［n（%），（±s）］

指标性别男女年龄＜45 岁≥45 岁体质量指数＜23 kg/m2≥23 kg/m2吸烟是否饮酒是否HBV DNA（log10 IU/mL）ALT（IU/L）AST（IU/L）GGT（IU/L）TBIL（μmmol/L）IL-6（ng/l）Hs-CRP（mg/L）TNF-α（μg/L）VitD（ng/ml）VDR mRNA VDR 蛋白HCC 组（n=20）15（75.00）5（25.00）6（30.00）14（70.00）9（45.00）11（55.00）9（45.00）11（55.00）8（40.00）12（60.00）5.87±1.22 60.14±10.23 39.63±5.69 35.41±5.14 14.78±3.25 104.35±30.26 15.47±5.06 1.56±0.31 40.58±9.32 2.74±0.32 1.16±0.39非HCC 组（n=82）62（75.61）20（24.39）47（57.32）35（42.68）37（45.12）45（54.88）15（18.29）67（81.71）11（13.41）71（86.59）4.85±0.97 57.25±9.84 37.14±5.12 33.94±4.83 14.21±2.98 68.41±23.59 10.23±4.15 1.12±0.25 65.41±12.48 1.69±0.22 0.78±0.42 χ2/t 值0.054 4.807 0.000 6.374 5.846 4.001 1.169 1.908 1.205 0.754 5.766 4.844 6.722 8.336 17.384 3.676 P 值0.816 0.028 0.992 0.012 0.016＜0.001 0.245 0.059 0.231 0.453＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 CHB 患者HCC 发生影响因素

Logistic 回归分析年龄、吸烟、饮酒、HBV DNA、IL-6、Hs-CRP、TNF-α、VitD、VDRmRNA 及蛋白表达均为CHB 患者HCC 发生影响因素（P＜0.05）。见表2。

表2 CHB 患者HCC 发生影响因素Table 2 Influencing factors of HCC in CHB patients

2.3 VitD、VDR 表达与炎症损伤程度的关系

Pearson 相关性可知，CHB 患者VitD 表达与炎症损伤程度指标IL-6、Hs-CRP、TNF-α 均呈负相关关系，VDRmRNA 及蛋白表达与炎症损伤程度指标IL-6、Hs-CRP、TNF-α呈正相关关系（P＜0.05）。见表3。

表3 VitD、VDR 表达与炎症损伤程度的关系Table 3 The relationship between the expression of VitD and VDR and the degree of inflammatory injury

2.4 VitD、VDR 表达对CHB 患者HCC 发生的预测价值

绘制ROC 曲线，评价VitD、VDR 表达对CHB患者HCC 发生的预测价值，发现VitD、VDRmRNA 及蛋白表达联合预测AUC 最大，且＞0.9，具有较高预测效能。见表4，图1。

表4 VitD、VDR 表达对CHB 患者HCC 发生的预测价值Table 4 The predictive value of VitD and VDR expression in the occurrence of HCC in CHB patients

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curve

3 讨论

HCC 是目前世界第五大常见肿瘤，位列癌症死亡原因第二位，其中70%与CHB 有关［10］。肿瘤形成是复杂的多因素作用过程，近年来，VitD 抗肿瘤作用日益受到重视。汪玲妹等［11］研究显示，VitD 可上调VDR 表达，增强IFN-JAK-STAT 信号途径，与IFN-α 协同发挥抗HBV 效应，而CHB 患者存在VitD/VDR 信号通路功能降低。由此可知，VitD 及VDR 表达可能在HCC 发生、发展中发挥重要作用，探讨其相关机制具有重要临床价值。

VitD 生物学效应主要由VDR 介导，VDR 分为膜受体（mVDR）和核受体（nVDR）。mVDR 主要维持钙磷平衡，而nVDR 本质是配体依赖的核转录因子，调节组织细胞增殖分化及其相应生物学功能。VitD 抗肿瘤作用主要通过与nVDR 结合实现。既往研究证实，VitD 可上调多种组织细胞VDR 蛋白表达，但对VDRmRNA 水平的调节存在明显组织细胞特异性［12］。VDR 广泛分布于机体各组织细胞中，VDR 在结肠癌［13］、乳腺癌［14］等癌组织中表达的研究发现，癌组织VDR 表达明显低于正常粘膜组织，且VDR 均表达于细胞核内。目前，已有研究在多种肝癌细胞系中发现VDR 表达［15-16］。提示VDR基因可能是肝癌易感基因，肝癌细胞可能是VitD 和VDR靶细胞。李玉苓等［17］研究显示，HCC 组织VDRmRNA 及VDR 蛋白表达量显著高于癌旁肝硬化组织、正常肝脏组织。通过实时荧光定量PCR 检测显示VitD、VDRmRNA 及蛋白表达均为CHB 患者HCC 发生影响因素。HCC 患者体内存在VitD/VDR 信号通路功能降低，与HCC 发生密切相关，这可能不利于药物发挥抗病毒作用，甚至加速HCC 进展。本研究还提示，HCC 及CHB 患者VitD 水平越低，VDRmRNA及蛋白表达越高，可能存在反馈调节关系。另外，肿瘤发生导致VDR 升高，还是VDR升高诱导肿瘤发生，尚需进一步研究。

CHB 患者肝功能损害并非由CHV 直接损害肝细胞所致，其发生、发展与患者细胞免疫功能关系紧密［18］。本研究发现，CHB 患者VitD 表达与炎症损伤程度指标IL-6、Hs-CRP、TNF-α 均呈负相关关系，VDRmRNA 及蛋白表达与炎症损伤程度指标IL-6、Hs-CRP、TNF-α 呈正相关关系。推测VitD/VDR 信号通路功能降低可能通过促进肝脏炎症性表现，加速CHB 向肝硬化及HCC 进展。本研究首次评价VitD、VDR 表达对CHB 患者HCC 发生的预测价值，ROC 曲线显示，VitD≤52.97 ng/mL、VDRmRNA＞2.13、VDR 蛋白＞1 时，均 高度怀疑HCC 发生，各指标联合预测AUC 达0.958，高于单独预测。因此，临床可同时检测VitD、VDRmRNA、VDR 蛋白，为CHB 患者HCC 发生预测提供更全面、有效的参考信息。

综上可知，CHB 患者VitD 与VDR 表达与炎症损伤程度有关，且可能参与HCC 发生发展过程，对HCC 发生具有较高预测价值。